Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Bu protokolün genel amacı, fare embriyoları üzerinde ışık tabakası mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak motor nöron akson arborizasyon paternlerinin kalitatif ve kantitatif değerlendirmesine izin vermektir. Bu yöntem, karmaşık hareketle koordineli olarak motor nöron gelişimini anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, motor nöronların akson arborizasyon modellerini çeşitli açılardan gözlemleyebilmeniz ve görüntüleyebilmeniz ve her bir siniri kantitatif olarak analiz edebilmenizdir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi olan Ya-Ping Yen ve Ee Shan Liau olacak. Bu işleme başlamak için, embriyoları 24 oyuklu bir plakaya, gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede oyuk başına PBS'de bir mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Ertesi gün, sabit embriyoları en az üç kez, her biri beş ila 10 dakika boyunca, bir mililitre 1X PBS ile yıkayın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, her bir embriyoyu bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca bir mililitre% 0.5 PBST'de geçirgenleştirin. Her numuneyi, bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 santigrat derecede 1X PBS'de hazırlanan bir mililitre %10 FBS ile bloke edin. Daha sonra, her embriyoyu bir mililitre anti-GFP primer antikoru ile 4 santigrat derecede 72 saat boyunca sürekli çalkalama ile inkübe edin.

Birincil antikor inkübasyonundan sonra, her embriyoyu bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki gün boyunca bir mililitre% 0.5 PBST ile yıkayın. Daha sonra, bir mililitre ikincil antikor uygulayın ve gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede sürekli çalkalama ile inkübe edin. Ertesi gün, her embriyoyu iki ila üç gün boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede en az üç kez bir mililitre% 0.5 PBST ile yıkayın.

Daha sonra, her bir embriyoyu, gece boyunca oda sıcaklığında ışıktan korunan 1.5 mililitrelik bir tüpte kırılma indisi 1.49 nd olan ticari bir temizleme reaktifinde inkübe edin. 5X/0.1 aydınlatma optiği ve 5X/0.16 algılama optiği ayarlayın. Numune tutucuyu ve numune kılcalını monte edin.

Numune haznesini temizleme solüsyonu ile doldurarak hazırlayın. Embriyoyu monte etmek için, üst kısmı kılcal damarın çapına uyacak şekilde keserek bir P200 pipet ucu hazırlayın ve numune eki için sivri kısmı çıkarın. Ardından, pipet ucunun körelmiş ucunu küçük bir alev kullanarak eritin.

Alevi söndürün ve embriyoyu erimiş uca dikey olarak hızlı bir şekilde tutturun. Pipet ucunun üst kısmını numune kılcal damarı ile takın ve hazırlanan numune haznesini mikroskoba koyun. Görüntüleme yazılımını kullanarak, Locate (Bul) sekmesi altında Locate Capillary (Kılcal Damarları Bul) öğesini seçin ve X, Y ve Z eksenlerini ayarlayın.

Ardından, Örneği Bul'u seçin ve embriyoya odaklanmak için 0,6X'e yakınlaştırın. Herhangi bir kalıntı veya kabarcıkları temizlemek için oda tamponunun bir süre embriyo ile dengelenmesine izin verin. Edinme sekmesi altında görüntü alımı için Dedektif Hedefleri, Lazer Engelleme Filtresi, Işın Ayırıcı, Kameralar ve Lazerler gibi ışık yolu parametrelerini tanımlayın.

Gölge azaltma için Pivot Taraması onay kutusunu işaretleyin. Ardından, 16 bit'e Bit Bepth, 0,36 ile 0,7X aralığına Zoom, tek site aydınlatması veya çift site aydınlatması gibi alım ayarlarını tanımlayın. Sürekli'ye tıklayın ve Lazer Yoğunluğu, Maruz Kalma Süresi, Lazer Gücü ve Işık Sayfası Konumunu ayarlayın.

Ardından, görüntü alımını sonlandırmak için Durdur'a basın. Şeffaf numunenin, tek tek motor sinirler üzerindeki ince ağaçlandırılmış yapıların görüntülerinin ayrıntılı olarak elde edilmesini sağlamak için en kısa ışık yolu içinde konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Çok boyutlu alım için, ilk ve son görüntü için z konumunu hareket ettirerek Z yığınını tanımlayın.

Dilim numarasını ayarlamak için En İyi'yi tıklatın. Ardından, seçili Z yığınını almak için Denemeyi Başlat'a tıklayın. Tamamlandığında, görüntüyü czi formatında kaydedin.

Akson arborizasyonunu ölçmek için, görüntü dosyasını görüntüleme analiz yazılımında açın. Yerel yoğunluk kontrastına dayalı olarak filamentleri algılamak için Ekran Ayarlama penceresini kullanarak görüntü rengini, parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Ardından, Yeni Filament Ekle simgesine tıklayın ve açılır menüden Otomatik Yol Algoritmasını seçin.

İlgilenilen bölgeyi seçin, ardından Dilim modu kullanılarak ölçülebilecek en büyük ve en ince çap ölçümlerini atayarak başlangıç ve tohum noktalarını tanımlayın. İlgilenilen bölgenin kenarına bir başlangıç noktası atayın. Başlangıç noktalarının el ile eklenmesini veya kaldırılmasını sağlamak için, önce işaretçi modunu değiştirin, seçimde gezinin ve ardından ilgi noktalarını kaydırıp sağ tıklayın.

Ardından, görünür ağaç iptalinin tümünün işaretlendiğinden emin olmak için tohum noktaları için manuel eşikleri seçin. Ardından, tohum noktalarını manuel olarak ekleyin veya kaldırın. Bağlantısı Kesilen Segmentleri Kaldır kutusunu işaretleyin ve başlangıç noktalarının etrafındaki tohum noktalarını kaldırın.

Ardından, arka plan çıkarma eşiğini ayarlayın ve işlemi tamamlayın. Doğru niceleme için arka plan artefaktlarını kaldırmak ve dedektör yolunun gerçek akson arborizasyonunu yansıttığını doğrulamak gerekir. Sonunda, istediğiniz stili ve rengi seçin.

İstatistikler sekmesi altında, Ayrıntılı'yı seçin ve motor akson arborizasyonunun bir göstergesi olarak motor sinir terminallerini ölçmek için filament sayısı, dendrit terminal noktalarını kullanın. Ardından, yeniden yapılandırılmış aksonun görüntüsünü bir tiff dosyası olarak dışa aktarın. LSFM, fare embriyolarında motor akson arborizasyonunun ayrıntılı 3D görselleştirmesini sağlar.

Motor nöronlar yukarıda tarif edilen protokole tabi tutulur ve transgenik olarak eksprese edilen GFP ile etiketlenir. Akson arborizasyonunu daha ayrıntılı olarak görüntülemek ve miktar tayini yapmak için büyütme, ince arborize edilmiş her yapının ortaya çıkabileceği şekilde ayarlanabilir. Son olarak, bireysel ön ayak sinirlerinin akson arborizasyon modeli, görüntü analiz yazılımı kullanılarak yeniden yapılandırılabilir.

Yazılımdaki otomatik yol algoritması, filamenti izler ve toplam akson terminali sayısını ölçer. Bu videoyu izledikten sonra, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanarak fare embriyolarının örneklerini nasıl hazırlayacağınızı ve motor nöron aksonlarını nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, MRS ile her bir motor sinirin arborizasyon modelini kantitatif olarak nasıl değerlendireceğinizi bileceksiniz.