Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Kurutma işlemi sırasında basit morfolojiyi yeniden düzenleyerek matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon kütle spektrometrisinde geleneksel yöntemi iyileştirmek için basit bir numune hazırlama prosedürü geliştirilmiştir. Bu tekniğin avantajı, bu optimize edilmiş yöntemle hazırlanan karbonhidrat numunelerinin sinyal yoğunluğunun etkili bir şekilde geliştirilebilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü metanol basınçsızlaştırma adımı çok önemlidir ve tek seferde yapılması gerekir.

Herhangi bir tereddüt veri kalitesini düşürecektir. Başlamak için, nitril eldiven giyerken, numune plakasını elde yıkamak için 100 mililitre deterjan solüsyonu kullanın. Plakayı elde yıkamak için damıtılmış-deiyonize veya DD su kullanın.

Daha sonra 30 mililitre metanol ile yüzeyini durulayın. Numune plakasını 600 mililitrelik bir behere yerleştirin ve plaka tamamen daldırılana kadar DD suyu ile doldurun. Ardından kabı ultrasonik bir banyoya yerleştirin ve plakayı 15 dakika boyunca sonikleştirin.

Numune plakasını beherden çıkarın ve su damlalarını üflemek için basınçlı nitrojen kullanın. Ardından, diğer noktalara yayılıp yayılmadığını kontrol etmek için numune plakasına 0,2 mikrolitre metanol bırakın. Eğer öyleyse, az önce gösterildiği gibi yıkama, sonikasyon ve azot tedavisini tekrarlayın.

Kurutma odasını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, mikro santrifüj tüpünde 0.25 mikrolitre 2, 5-Dihidroksibenzoik asit çözeltisi ve 0.25 mikrolitre Sialil-Lewis A veya maltoheptaoz çözeltisini önceden karıştırın. Ardından tüpü üç saniye boyunca girdaplayın. Karışık çözeltiyi mini santrifüjde iki saniye boyunca 2000 kez G'de döndürün.

Ardından, önceden karıştırılmış çözeltinin 0.1 mikrolitresini hemen numune plakasına pipetleyin. Numune kuruduğunda, buharlaşmayı önlemek için hızlı bir şekilde çalışırken, 0,2 mikrolitre metanolü doğrudan numune noktasına pipetleyin. Numune yeniden çözülecek ve ardından hemen kuruyacaktır.

Metanol biriktirme adımı, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliği belirleyen en zor adımdır. En iyi performansı sağlamak için, metanolün önemli buharlaşma kaybını önlemek için kullanıcının biriktirme işlemini üç ila beş saniye içinde bitirmesini öneririz. Nitril eldiven giyin ve numune plakasını kurutma odasından dikkatlice çıkarın.

Daha sonra mikroskop altında numuneyi inceleyin. Kristal morfolojileri beklendiği gibi değilse, numuneyi karıştırmayı ve numune plakası üzerine lekelemeyi tekrarlayın. Numune kristallerinin yeniden kristalleşmeden sonra optimum morfolojiye sahip olduğundan emin olmak için, bunları incelemek için her zaman bir mikroskop kullanın.

Kristal morfolojisinin kalitesini çıplak gözle doğru bir şekilde belirlemek zordur. Bir mikrolitrelik bir numuneyi analiz etmek için, 2.5 mikrolitre 2, 5-Dihidroksibenzoik asit çözeltisi ve 2.5 mikrolitre Sialil-Lewis A veya maltoheptaoz çözeltisini bir mikro santrifüj tüpünde önceden karıştırın. Önceden karıştırılmış çözeltiyi beş saniye boyunca girdaplayın.

Karışık çözeltiyi iki saniye boyunca 2000 kez G'de döndürün, ardından önceden karıştırılmış çözeltinin bir mikrolitresini hemen numune plakasına pipetleyin. Numune kuruduktan sonra, 1,5 mikrolitre metanolü doğrudan kurutulmuş numune noktasına pipetleyin. Numune yeniden çözülür ve hemen kurur.

Numuneyi kurutma odasından dikkatlice çıkarın. Numuneyi mikroskop altında inceleyin. Kristal morfolojileri beklendiği gibi değilse, çözelti hazırlığını az önce gösterildiği gibi tekrarlayın.

Kütle spektrometresi yapmak için kütle spektrometresi kontrol yazılımını açın ve numune plakasını makineye yerleştirin. Yazılımda önceden optimize edilmiş veri toplama yöntemini seçin, ardından görüntüleme yazılımını kullanarak tüm numune bölgesini görüntüleme kütle spektrometresi için kaydedin. Kontrol yazılımının toplu modunda veri toplamayı başlatın.

Veri toplama işlemi tamamlandığında, iyon görüntülerini çizmek ve verileri metin protokolüne göre analiz etmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Kurutulmuş damlacık ve yeniden kristalleştirme yöntemleri kullanılarak hazırlanan 2, 5-Dihidroksibenzoik asit ile karıştırılmış Sialyl-Lewis A'nın temsili SEM görüntüleri burada gösterilmektedir. Tipik bir 2, 5-Dihidroksibenzoik asit morfolojisi, kenarda büyük, iğne şeklindeki kristaller ve numune noktalarının merkezinde ince kristal yapılardır.

Metanol ile yeniden kristalleştirildikten sonra, numune ince, pul benzeri kristallerle eşit şekilde kaplanmış daha geniş bir alana sahiptir. Bu şekil, metanol yeniden kristalizasyonu olan ve olmayan Sialil-Lewis A ve maltoheptaozun görüntüleme kütle spektrometresi sonuçlarını göstermektedir. Yeniden kristalleşmeden sonra, Sialyl-Lewis A ve maltohepaoz sinyallerinin dağılımı, numune noktalarının parlak alan görüntüleriyle iyi bir şekilde eşleşir.

Yeniden kristalize edilmiş karbonhidrat numunelerinin sinyal yoğunlukları da geleneksel kuru damlacık numunelerine kıyasla geliştirilmiştir. Bu grafik, yeniden kristalize edilmiş numunelerin sodyum veya pozitif iyon modunun ve protondan arındırılmış veya negatif iyon modu karbonhidratlarının sinyal yoğunluğunu, kurutulmuş damlacık numunelerininkine göre karşılaştırır. Ortalama olarak, Sialyl-Lewis A ve maltoheptaoz örneklerinin yeniden kristalleşmesi, sodyum sinyalleri 3.9 ve 3.3 faktörleriyle arttırdı.

Protondan arındırılmış Sialil-Lewis A iyon sinyalleri, yeniden kristalleşmeden sonra 4.7 faktörü ile arttırıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa bu teknik kullanılarak numuneler 10 dakika içinde hazırlanabilir. Bu prosedürü denerken, metanol damlacığının numune noktasına derhal ve hassas bir şekilde bırakılması önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, rutin analiz için en iyi iyon sinyallerini elde etmek için çoklu numunelerin kristal morfolojisini etkili bir şekilde nasıl kontrol edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.