Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Bu yöntem, yetişkin insanların bağırsaklarındaki enterik gangliyonların ekspresyon profili gibi enterik sinir sistemi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RNA kalitesini maksimum düzeyde korurken insan enterik gangliyonlarından yüksek RNA verimi elde etmek için kullanılabilmesidir. 20 santimetre uzunluklarda kesilmiş bağırsak dokusu ile başlayın.

İlk olarak, yağ ve bağ dokusunu kesin. Mienterik pleksusta yapısal hasara yol açabilecek serozayı çentiklemekten kaçının. Daha sonra, kesilmiş numunenin tüm uzunluğu boyunca, tercihen mezenterik bağlantı bölgesinde uzunlamasına bir kesi yapın.

Daha sonra, taeniae coli'yi kolondan ayırın ve atın, böylece doku düzleşebilir. Şimdi, bağırsağı, mukoza tarafı aşağı bakacak şekilde, soğutulmuş bir kesme tahtasına serin. Ardından, dokunun tüm uzunluğu boyunca 1,25 santimetre genişliğinde şeritler kesin.

Kesildikleri gibi, her bir parçayı geçici depolama için soğutulmuş doku saklama solüsyonuna aktarın. Ardından, her şeridi iki ila 1,5 santimetre uzunluğunda segmentler halinde kesin. Bir şeridi segmentlere ayırdıktan sonra, segmentleri kurulayın.

Dokunun çok kuru olması önemlidir, bu nedenle donduğunda doku üzerinde buz kristalleri oluşmaz. Şimdi, kurumuş doku parçalarını, mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde soğuk, tek kullanımlık plastik bir kalıba yerleştirin. Ardından, sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için kavisli forseps kullanarak her parçayı düzleştirin.

Dokular düzleştikçe genişleyecektir. Doku segmentlerini düzleştirdikten sonra, dondurmadan önce kalınlıklarını değerlendirin. Gerekirse, bağırsak numunesi orijinal kalınlığına yaklaşana kadar numunenin kenarlarını içeri doğru itin.

Şimdi, yüklü taban kalıbını kuru buz ve 2-metilbütan bulamacına aktarın. Doku 30 ila 60 saniye içinde tamamen donmalıdır. Ardından, kuru buz üzerinde bekletilmiş soğuk mendiller kullanarak kalıbın altını hemen kurulayın.

Şimdi, örneği kontrol edin. Düz görünmeyen örnekleri not edin. Ardından, kalıbı kullanmadan önce önceden etiketlenmiş ve soğutulmuş alüminyum folyoya sarın.

Ardından, dehidrasyonu en aza indirmek için folyoyu bir plastik örtü tabakası ile örtün. Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklanana kadar buz üzerinde tutun. Gerekli malzemeleri hazırladıktan sonra, üç ila beş milimetrelik bir TFM höyüğünü büyük bir kriyostat numune tutucusuna dökün ve bağırsak numunesini hemen seroza tarafı yukarı bakacak şekilde TFM'ye aktarın.

Oda sıcaklığında birkaç saniye bekledikten sonra, numune tutucuyu kuru buza aktarın ve üzerini toz haline getirilmiş kuru buzla kaplayın. Dilimlemeden önce, TFM'nin myenterik pleksus düzleminin altında olduğundan emin olun. Ardından, numune tutucuyu kriyostat numune kafasına monte edin ve numuneyi kriyostat bıçağı ile hizalayın.

Myenteric pleksus düzlemini kesme bıçağına paralel hale getirin. Şimdi, myenterik pleksusa ulaşana kadar seroza ve uzunlamasına kas boyunca sekiz mikronluk kesitler yapın. Mienterik pleksusu bulmak için bir numune monte edin ve %1 kristal menekşe gibi sulu bir boya ile boyayın.

Devam etmek için, uzunlamasına ve dairesel kas katmanları arasındaki bağlantıyı tanımlayın. Bölümlemenin başlangıcında, seroza bağ dokusunun varlığı ile işaretlenecektir. Seroza boyunca kalan bir miktar mezenterik yağ da mevcut olabilir.

Daha sonra, dış uzunlamasına kas tabakasının tabakası görünür hale gelir Uzunlamasına ve dairesel kas tabakaları arasındaki sınıra ulaşıldığında, enterik ganglionların bir kısmı gözlenecektir. Sonraki birkaç bölümde, myenterik pleksus, tek bir bölümde geniş gangliyon alanlarının bulunmasıyla çok belirgin hale gelecektir. Şimdi, lazer yakalama mikrodiseksiyonu için seri kesitler toplayın.

PEN slaytlarını kriyostatta beş ila 10 saniye soğutun ve bunları bölümleri monte etmek için kullanın. En iyi bölümlerde çok sayıda nöron ve glia olacaktır. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı gibi bölümleri boyamaya ve ardından kurutmaya devam edin.

Hazırlık olarak, LCM mikroskop aşamasına bir LCM kapağı kartuşu yerleştirin. Ardından, örnek slaydı sahne alanına yükleyin ve slaydın genel bakış görüntüsünü elde edin. LCM için istenen konumu belirleyin ve slayta bir kapak yükleyin.

Ardından, kızılötesi lazeri hizalayın ve 20 ila 30 mikron çapında bir yakalama noktası için lazerin gücünü ve süresini ayarlayın. Ardından, toplanacak istenen gangliyonları ana hatlarıyla belirtin. Kapaktaki yeşil bir daire olarak görüntülenen toplanabilir alanın sınırları içinde kaldığınızdan emin olun.

Bir UV kesme izi ile özetlenen ganglionların her biri için, IR noktalarını, her 100 ila 500 mikronda en az bir IR noktası olacak şekilde ayarlayın, böylece kapak numuneden kaldırıldığında ganglionların tümünün toplanmasını sağlayın. Ardından, işaretli tüm gangliyonların toplanmasına devam etmek için IR UV Cut düğmesine basın. Koleksiyonlar tamamlandıktan sonra, kapağı yeni bir konuma taşıyın ve toplama işlemini tekrarlayın.

Bu 60 ila 80 dakika boyunca tekrarlanabilir. LCM kapağına yeterli ganglion yüklendiğinde, bir kalite kontrol istasyonuna aktarın. Kapakta kalıntı varsa, RNA kullanımı için hazırlanmış ince uçlu bir boya fırçası kullanarak silin.

Çıkarılması zor kalıntılar için bir pipet ucu kullanın. Ardından, kapağı 230 mikrolitre RNA lizis tamponu ile doldurulmuş 0,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne sabitleyin. Kapağı ters çevirin, kısaca girdap yapın ve ardından numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, numuneyi 5.000 g veya daha hızlı bir şekilde beş dakika santrifüjleyin ve ardından mikrofüj tüpünü kuru buza aktarın. Numune artık RNA ekstraksiyonu için hazırdır. Örnek başına iki enterik gangliyon kapağı çekerken, RNA-Seq için yeterli olan bir nanogramdan daha fazla RNA elde edildi ve RNA mükemmel kalitedeydi.

Gösterilen örneğin RNA bütünlüğü 8.3'tür. Bütünlük numaraları 7.5 ve 6.9 olan örnekler de toplanmıştır. Toplamda, hazırlanan tüm numunelerin %95'inden fazlası RNA-Seq için yeterince iyi olmuştur.

RNA-Seq veri setlerinin kalitesi, bir biyoinformatik boru hattı kullanılarak değerlendirildi. Uç yanlılığı, örneklerin başarılı bir şekilde sıralandığını ve yalnızca mütevazı bir üç asal uç yanlılığına sahip olduğunu gösterir. Bir gen biyotip grafiği, dizileme sonuçlarının büyük ölçüde tutarlı olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, RNA-Seq için yeterli kalite ve miktardaki enterik gangliyonlardan RNA'nın biyolojik kopyalarını sekiz ila 12 saat gibi kısa bir sürede toplamak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, insan bağırsak örneklerinin mümkün olduğunca düz bir şekilde dondurulması önemlidir. Bu, lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile hızlı ve kolay bir şekilde işlenen insan enterik gangliyonlarının çok büyük kesitlerini toplayabilmenizi sağlayacaktır.