Kapsül tutarı kesintili yoğunluk Gradient kullanarak bakterilerin ayıran
7 Ocak 2019
Bakteriyel nüfus kapsül üretim temel alarak ayırmak için kesintili yoğunluk gradyanlar kullanımını göstermektedir. Bu yöntem kapsül kültürler arası karşılaştırmak, belirli bir kapsül fenotip mutantlarla yalıtmak veya kapsül düzenleyiciler belirlemek için kullanılır. Burada açıklanan en iyi duruma getirme ve tahlil çalıştırılmasını olduğunu.
Bu yöntem Klebsiella alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, hangi genler kapsül ve ilişkili öldürücüler düzenlemek için kullanılır gibi. Bu tekniğin başlıca avantajları, kapsüllü ve kapsülsüz suşları fiziksel olarak ayırmak için bir araç sağlar ve aynı zamanda kapsül üretim suşları arasında hızlı karşılaştırmalar için kullanılabilir. Bu yöntem Klebsiella kapsül regülasyon çalışması için geliştirilmiş olmasına rağmen, aynı zamanda farklı bakteri türlerine uygulanabilir.
Bu yönteme yeni olan bireyler, degradeleri dökmek ve hücreleri degradelere eklemek oldukça zor olabileceğinden mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü ustalaşması zor olan teknikleri gösteririz, kullanıcıya yardımcı olmak için öneriler ve ipuçları sağlarız. Başlamak için, steril bir döngü ile bir stok plaka tek bir koloni seçin ve uygun bir et suyu 10 mililitre aşılamak.
Bir gecede kültürü kuluçkaya yatırın. Sonra 15 mililitrelik tüp ve santrifüj için kültür aktarın. Daha sonra, supernatant atın ve PBS iki mililitre pelet yeniden askıya.
Santrifüj'u tekrarlayın ve ortaya çıkan supernatant'ı atın. Sonra pbs iki mililitre pelet yeniden askıya. Yoğunluk gradyan seyreltmelerini oluşturmak için yoğunluk gradyan ortamını PBS ile birleştirin.
Sonra her bir degrade seyreltme 600 mikrolitre tek tek iki mililitre tüpler içine aliquot. 200 mikrolitrelik pipetli 100 mikrolitre hücre alın ve pipet ucunu tüpün yan tarafına birçok degradeden birinin menisküsünün hemen altına yerleştirin. Bakteri hücrelerini çok yavaş bir şekilde degradeye aspire edin, arayüzü karıştırmamaya özen gösterilsin.
8, 000 g's 10 dakika için hazırlanan tüpler santrifüj. Bundan sonra, degrade tabakasının hemen üzerinde hücreleri korumak için gerekli minimum degrade seyreltme görselleştirmek için bir raftüpleri aktarın. İlk olarak, beş mililitrelik yuvarlak alt tüp içine en seyreltik yoğunluk gradyan seyreltme bir mililitre aktarın.
1.5 inç iğne ile bir şırınga kullanarak, sonraki en konsantre yoğunluk gradyan bir mililitre almak. İğneyi tüpün altına yerleştirin ve şırınganın içeriğini çok yavaş enjekte edin. Yoğunluk degradesinin her adımında net bir arayüz olmalıdır.
Eğer katmanlar karışırsa, bakterilerinizin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlayamaz. Degrade seyreltmeleri arasındaki arabirimi rahatsız etmemek için iğneyi degradeden hafifçe çıkarın. Sonra bir rafa tüp yerleştirin.
Dikkatle tüp gradyan üstüne hazırlanan hücrelerin 600 mikrolitre ekleyin. Sonra bir tüp adaptörü tüp yerleştirin ve denge sağlamak için adaptör ile tüp tartmak. Bundan sonra, bir tezgah üstü santrifüj içinde sabit bir açı rotor tüp adaptörü yerleştirin ve 30 dakika boyunca tüp santrifüj 3, 000 g's.
Son olarak, santrifüjden sonra tüpü dikkatlice çıkarın, rafa yerleştirin ve sonuçları fotoğraflayın. Bu protokolde, yoğunluk gradyan santrifüj ürettikleri kapsüle göre bakteri suşlarını ayırmak için kullanılmıştır. Kesin sonuçlar bakteri türlerine bağlı olsa da, çoğu suş degrade içinde tek bir konuma göç edecektir.
Bir bakteriyel mutant kütüphane için bu yöntemin uygulanması degrade üzerinde büyük bir bant, degrade üst tabakası ile daha az yoğun bir bant ve alt kısmında küçük bir acapsular fraksiyonu üretmelidir. Bu yordamı çalışırken, degrade arabirimleri karışık olmamalı ve degrade hava kabarcıkları içermemelidir hatırlamak önemlidir. İşlemden sonra kapsül miktarlarını incelemek için üronik asit tonu veya mikroskopi gibi doğrulama yöntemleri yapılmalıdır.
Bu özellikle yeni suşlar için bu tekniği kullanırken önemlidir. Hazard Group 2 patojenleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Düzeltici koruyucu ekipman, risk değerlendirmelerine bağlı kalma ve kültürlerin doğru bir şekilde atılması gibi önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.
Genel Bakış
Bu makale, bakteri popülasyonlarını kapsül üretimine göre ayırmak için kesikli yoğunluk gradyanlarının kullanımını göstermektedir. Bu yöntem; kültürler arasındaki kapsül miktarlarının karşılaştırılmasına, spesifik kapsül fenotiplerine sahip mutantların izole edilmesine ve kapsül düzenleyicilerinin tanımlanmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Patojen Araştırmaları
Arka Plan
- Bakterilerde kapsül üretimi virülans ile ilişkilidir.
- Kapsül regülasyonunun anlaşılması, tedavi stratejilerine ışık tutabilir.
- Süreksiz yoğunluk gradyanları fiziksel bir ayırma yöntemi sunar.
- Bu teknik çeşitli bakteri türlerine uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kapsüllü ve kapsülsüz bakteri suşlarını ayırmak için bir yöntemi optimize etmek.
- Farklı suşlar arasındaki kapsül üretimi karşılaştırmalarını kolaylaştırmak.
- Tekniğin daha iyi anlaşılması için görsel bir gösterim sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteri kültürlerinin inokülasyonu ve gece boyu inkübasyonu.
- Santrifüjleme ve bakteri peletlerinin PBS içinde yeniden süspansiyonu.
- Yoğunluk gradyanı dilüsyonlarının hazırlanması ve hücrelerin dikkatle katmanlandırılması.
- Kapsül üretimine dayalı ayrımı sağlamak için santrifüjleme.
Temel Sonuçlar
- Kapsül üretim seviyelerine göre bakteriyel suşların başarılı bir şekilde ayrıştırılması.
- Kapsüllü ve akapsüler fraksiyonlara karşılık gelen belirgin bantların tanımlanması.
- Uronik asit analizleri gibi doğrulama yöntemleri ile kapsül miktarlarının teyit edilmesi.
- Temiz bir ayrıştırma için gradyan ara yüzeylerinin korunmasının öneminin kanıtlanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, Klebsiella ve diğer bakterilerde kapsül düzenlemesini incelemek için etkilidir.
- Tekniğe hakim olmak için görsel gösterimler kritik öneme sahiptir.
- Patojenik suşlarla çalışırken güvenlik önlemleri esastır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Bu yöntem, biyoilaç Ar-Ge ekiplerinin, immün kaçış ve terapötik direnci etkileyen temel bir virülans faktörü olan kapsül ekspresyonuna göre bakteriyel alt popülasyonları fiziksel olarak izole etmesini sağlar. Yarı kantitatif bir ayırma aracı sunarak, antimikrobiyal ve aşı geliştirme programlarında hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Bu yaklaşım, suş kütüphaneleri veya mutant koleksiyonlarında kapsülle ilişkili fenotipler değerlendirilirken öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yüksek ve düşük üretim yapan suşları sonraki genetik analizler için ayırarak kapsül biyosentez yollarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kapsül üretim regülatörlerini belirlemek için mutant kütüphanelerinin hızlı fenotipik taramasını kolaylaştırır.
- Translasyonel Değer: Virülans modelleme ve antijen seçiminde kullanılmak üzere akapsüler veya hiperkapsüler mutantların izolasyonunu destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Uronik asit ölçümü gibi kantitatif kapsül analizleri için uygun, fraksiyonlanmış popülasyonlar oluşturur.
- Operasyonel Değer: Kapsül ekspresyonunu etkileyen bileşiklerin veya genetik perturbasyonların yüksek kapasiteli taramaları için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir girdiler sağlar.
- Analiz Hazırlığı: Sonraki fonksiyonel veya immünolojik analizlerde sinyal-gürültü oranlarını artıran saflaştırılmış kapsüllü fraksiyonlar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değeri: Transpozon insersiyon bölgelerinin sekanslama iş akışlarındaki kapsül seviyeleriyle korelasyonuna olanak tanıyarak genotipi fenotiple ilişkilendirir.
- Operasyonel Değeri: Farmakokinetik veya etkinlik çalışmaları için tanımlanmış kapsül miktarlarına sahip izojenik suşlar üretmek amacıyla ölçeklenebilir bir yöntem sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Ekiplerin valide edilmiş kapsül modülasyonuna dayanarak hedeflerin riskini azaltmalarına imkan tanıyarak risk ayarlı ilerlemeyi destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken keşif sürecine uygun olup, özellikle kapsülün patojenite belirleyicisi olduğu anti-enfektif programlarda, fenotipik taramadan hedef tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya geçişe olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Kapsülün bağışıklık sisteminden kaçış veya stres direncindeki rolünü netleştirmek için suşların fiziksel ayrımına olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Farklı suş varyantları veya tedavi koşulları arasında kapsül üretiminin kantitatif karşılaştırması için analize hazır fraksiyon toplama imkanı sağlar.
- Analitikler: Ayıklama ve ileri analitik doğrulama için yarı kantitatif okumalar sağlayan belirgin, görsel bantlar oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Enfeksiyon veya challenge çalışmaları için tanımlanmış fenotipik suşlar sağlayarak, keşif aşamasındaki kapsül modülasyonunu preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bir portföydeki birden fazla bakteriyel hedef için uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir kapsül fenotipleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fenotip-genotip korelasyonuna doğrudan olanak tanıyarak kapsül bağlantılı virülansla ilgili mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Toplu kültür ölçümleriyle karşılaştırıldığında, kapsül analizinde tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu artırır.
- Stratejik Değer: Kapsül modülasyon etkinliği hakkında ampirik veriler sağlayarak hedef seçimindeki devam/durdur (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış kapsül fenotiplerine dayanarak antimikrobiyal veya aşı hedeflerinin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Bakteri kültürü yönetimi ve yoğunluk gradyanı hazırlama konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hassas hız ve sıcaklık kontrolü yapabilen santrifüj ekipmanına erişime bağlıdır.
- Kurulum sırasında gradyan katmanlarının karışmasını veya hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli bir teknik gerektirir.
- Gradyan konsantrasyonlarının ve santrifüj parametrelerinin optimizasyonu yoluyla her bakteri türü için uyarlanmalıdır.
- Fraksiyonlardaki kapsül seviyelerini doğrulamak için biyokimyasal analizler veya mikroskopi gibi ayrıştırma sonrası doğrulama yöntemlerine dayanır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Bacterial Strains of Mutant Libraries
1:40
Preparation of Gradient Dilutions and Mini-gradient Test
2:39
Preparation of Discontinuous Density Gradients
3:39
Adding Prepared Cells to Gradients and Separation by Centrifuge
4:30
Results: Density Gradient Centrifugation Used to Separate Bacterial Strains Based on Capsule Production
5:10
Conclusion
