Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Bu yöntem, oruç ve obezite gibi farklı metabolik koşullara göre hücreler arası etkileşimlerin ve yağ dokusu fizyolojisinin nasıl değiştiği gibi yağ biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, orijinal yağ 3D yapısını en iyi şekilde koruması ve genellikle konvansiyonel immünohistokimya için gerekli olan uzun işleme adımlarından kaçınmasıdır. Bu yöntem yağ dokusunun yapısına ışık sağlasa da, beyinde tam montaj boyama ile sinir sistemi gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler mülkiyet doku siteleri alma zorlukları nedeniyle mücadele edecek, uygun fiksasyon dönemi bulma, ve optimal antikor konsantrasyonları. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, %1 paraformaldehitteki doku örneklerini içeren kabı buzdan oda sıcaklığına bir saat aktarın. Daha sonra daha hızlı yıkama için 12 veya 24-iyi hücre kültür plakası dokuları aktarın.

Tüm montaj boyama işleminin diseksiyondan hemen sonra başlaması gerektiğini ve her adım arasında duraklama noktası olmadığını unutmamak önemlidir. PBS-0.3T ile dokuları 22 derecede eğilmiş bir çalkalayıcıda, oda sıcaklığında dakikada 20 ila 25 eğim hızıyla beş dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Bundan sonra, %5 hayvan serumu içeren yaklaşık 0,5 ila bir mililitre bloke tampon ekleyin. Bir saat için önceki koşulları kullanarak bir shaker üzerinde plaka kuluçka. Engelleme çözeltisini aspire edin ve PBS-0.3T'de seyreltilmiş primer antikorların mililitresini her kuyuya %1 hayvan serumu ile ekleyin.

Plakayı bir gecede 4 santigrat derecede, 22 derece eğim ve dakikada 20 ila 25 eğim hızıyla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beş dakika oda sıcaklığında dokuları yıkamak için PBS-0.3T kullanın. Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, her kuyuya 0,5 ila bir mililitre uygun ve seyreltilmiş ikincil antikor çözeltileri ekleyin. Alüminyum folyo plaka sarın ve bir saat oda sıcaklığında bir shaker üzerinde kuluçka. Bundan sonra, yıkama başına beş dakika oda sıcaklığında PBS-0.3T ile iki kez plaka yıkayın.

Nötr lipid lekesi sırasında sıvı damlacıklarının görüntülenmesi gerekiyorsa, her yıkama beş dakika süren 1x PBS ile iki kez yıkayın. PBS seyreltilmiş nötr lipid leke ekleyin ve oda sıcaklığında kuluçka 30 dakika. Görüntülemeye başlamak için, 24'e 60 milimetrelik cam kapak fişinin üzerine doku düz döşenmek için terpler kullanın.

DAPI ile çekirdek boyama isteniyorsa, dokuyu tamamen batırmak ve kurumasını önlemek için DAPI içeren bir montaj ortamının bir ila iki damlaekleyin. Daha sonra, ters bir confocal lazer mikroskop sistemi üzerine slayt yerleştirin. Birden fazla odak düzleminde tam montajlı lekeli doku görüntülerini elde etmek için, istenilen büyütme de dört ila altı mikrometre adım boyutu ile derinliği nde 100 ila 150 mikrometre Z yığınları gerçekleştirin.

Bu çalışmada yağ dokusu mimarisini korumak için tam montaj boyama kullanılmıştır. Birden fazla işleme adımları ve kesit içeren yöntemlerin aksine, hangi yağ dokusu morfolojisi şekil bozukluğuna yol açabilir, tüm montaj boyama yöntemi adipositlerin morfolojisi koruyabilir, sonuçları yorumlarken doğruluk sağlanması. Yağ dokusunun aşırı fiksasyonu fiksatif kaynaklı floresan yol açar, hangi aynı bölgeleri örtüşen tarafından endike olabilir, tirozin hidroksilaz ve PECAM-1 sinyalleri burada görülen gibi.

Düzgün sabit, tam montaj leke örnekleri, ancak, bu sinyaller otofloresan olmadığını belirten ayrı ve farklı sinyaller göstermektedir. Tüm montajlı lekeli yağ dokusunun görüntülenmesi, farklı deneysel koşullar altında morfolojik değişikliklerin ölçülmesine olanak sağlar. Özellikle, yağ dokusu yüksek vaskülarize, hangi enerji düzeyinde hızlı değişiklikler üzerine metabolik homeostaz aracılık önemlidir.

Örneğin, 24 saatlik oruç tutan C57 siyah 6J fareler, lipoliz olduğunu gösteren önemli ölçüde daha küçük bir adiposit boyutu ve sürekli beslenen farelerle karşılaştırıldığında kan damarı yoğunluğunda bir eğilim gösterir. iDISCO+ile yağ dokularının temizlenmesi yağ dokularının optik olarak saydam olmasını sağlar. Doku açıklığına geçmiş yağ dokusunun immünetiketleme aynı büyütme doku temizleme olmadan tam montaj boyama gözlenen göre çok daha yoğun nöral arborization gösterir.

Bu yordamı denerken, PFA oda sıcaklığında bir saatten fazla numuneleri aşırı yayıltmamak için hatırlamak önemlidir, aksi takdirde, bu arka plan otofloresansını artıracaktır. Ancak, numuneler dört santigrat derecede sabitlenirse bu fiksasyon süresi uzatılabilir. Bu prosedürü takiben, ImageJ kullanarak nicelleştirme gibi diğer yöntemler, adiposit siteleri ve kan damarı yoğunluğu gibi hücresel mimari, çeşitli fizyolojik koşullara yanıt olarak nasıl değiştirmek gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir.