Mikroelektrot Impalement yöntemi bir kanüle orta serebral arter membran potansiyelini kaydetmek için

Bu protokol, normal ve hastalıklı kan damarlarının membran potansiyelini ölçmek ve membran potansiyelini, vasküler tonuve kan akışını modüle eden farmakolojik ajanları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknikten üretilen membran potansiyelleri, damar içindeki vasküler düz kaslar bir senitoyumda olduğundan fizyolojik menzile yakındır. İşleme başlamadan önce, çift kanallı diferansiyel elektrometre amplifikatörü istediğiniz yere yakın bir damar odasına yerleştirin.

Amplifikatör kanalı A veya B çıktısını dijitalleştiricinin kanal girişine bağlamak için BNC-BNC kablosu kullanın. Sondayı mikromanipülatöre monte edin ve mikromanipülörü titreşimsiz bir masaya mikroskopa ve miyografa doğru çevirin. Düğmeleri ve anahtarları kılavuzda açıklandığı gibi deney için uygun konumlara amplifikatörün önüne yerleştirin.

Daha sonra banyo zeminini uygun bir elektrotla amplifikatörün devre zeminine bağlayın ve kafesin amplifikatörün şasisine toprakladığından emin olun. Borosilikat cam mikroelektrotları hazırlamak için, daha az bir mikrometre çapı ile kısa, kademeli, sekiz ila 10 milimetrelik konik elde etmek için standart bir çekmece kullanın, daha yüksek dirençler ve daha küçük ipuçları için iki kez döngü. Üç molar potasyum klorür ile mikroelektrot doldurmak için bir mikrofiber şırınga kullanın, yavaş yavaş sıvı doldurmak için alan sağlamak ve mikroelektrot içinde kabarcıklar oluşumunu önlemek için enjeksiyon sırasında piston geri çekerek.

Tam yüklü mikroelektrotu mikroelektrot tutucuya yerleştirin ve elektrot sapını sıkılmış delikten tutucuya dikkatlice itin. Laboratuvar dokusu olan fazla sıvıyı çıkarın ve elektrot tutucu tertibatını amplifikatör sondasına bağlayın. Elektrot direncini ölçmek için bir elektrot testi yapın.

Ardından kayıt yazılımını açın, dosyaya bir ad atayın ve dosyayı gelecekteki çözümlemelere kaydedin. Daha sonra, normal fizyolojik tuz çözeltisi beş mililitre veya PSS ile oda yüklemeden önce distile su ile miyograf odası nı birkaç kez durulayın. Beş veya 10 mililitrelik şırınga kullanarak, her iki cam kanülleri ve bağlı tüpü herhangi bir hava kabarcığı getirmeden filtrelenmiş normal PSS ile doldurun ve 10-0 monofilament naylon dikişlerde yarım düğüm yapmak için künt forseps kullanın.

Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon forsepskullanarak, ipuçları biraz uzakta her iki kanüller üzerinde kısmen kapalı dikiş düğümleri yerleştirin. Orta serebral arter izolasyonu için, sıçan beyninin 100 ila 200 mikrometrelik iç çapı olan orta serebral arterin dallanmamış bir bölümünü tanımlamak ve incelemek için yay makasve forsepskullanın. Cam kanüller üzerine orta serebral arter monte etmek için ince forceps kullanın, ve kanül arter güvenli dikişleri sıkın.

Distal kanülü kapatArak arter içinde akış olmayacak ve giriş pipetini PSS rezervuarına bağlayın. Ters mikroskop ve görüntüleme yazılımı üzerine monte edilmiş şarj lı bir cihaz kamera kullanarak kanüle edilmiş orta serebral arteri görselleştirin. MCA'nın eksenel uzunluğunu, ne sert ne de sarkık görünecek şekilde yaklaşık bir uzunluğa ayarlayın.

Banyo çözeltisini %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede dengeleyin. Amplifikatörün zeminini miyografın PSS'sinde batırın. Kap odasını aydınlatın ve banyo çözeltisindeki mikroelektrotun ucunu mikroskop aracılığıyla görselleştirin.

Mikromanipülörü kullanarak, mikroelektrotun ucunu kan damarının dış duvarına yaklaştırın ve kaydı başlatın. Mikroelektrotun ucunu yavaşça damara doğru hareket ettirin ve geminin merkezine doğru ilerleyin. Ucu damara yakın geldiğinde, kas zarını kazımak için elektrotileri hızlı bir hareketle ilerletin.

Membran delindikten sonra membran potansiyelinde değişiklikler gözlemlenebilir. Membran kazındıktan sonra mikromanipülatöre dokunmayın. Membran potansiyel değişiklikleri kaydedildiğinde, tek bir hızlı hareketle mikroelektrotu çıkarmak için manipülatörü kullanın ve veri dosyalarını kaydetmeden önce kaydı durdurun.

Negatif değerlere hızlı bir sapma olduğunda, membran potansiyeli en az 30 saniye boyunca sabit olduğunda ve elektrotun çıkarılmasıyla voltaj aniden sıfır milivolta döndüğünde impalement başarılı kabul edilir. Başarılı bir impalement ve membran potansiyeli stabilizasyonundan sonra, ilgi çekici ilaçlar banyoya nüfuz edebilir ve membran potansiyelindeki değişiklikler kaydedilebilir. Bu temsili deneyde, potasyum klorür ile perfüzyon membranı yaklaşık altı milivolt depolarize ederken, büyük iletkenlik kalsiyum aktivatörü ile perfüzyon membranı yaklaşık dört milivolt hiperpolarize etti.

Hatırlanması gereken en önemli şey, mikrometreçapı daha az olan kısa ve kademeli koniklere sahip yüksek dirençli mikroelektrotları çekmektir.