Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme
26 Ocak 2019
RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.
Geleneksel çift iplikli RNA algılama testi genellikle negatif anlamda RNA virüs enfeksiyonunda oluşan çift iplikli RNA'yı algılayacak kadar hassas değildir. Bu nedenle çift iplikli RNA ve konak desen tanıma reseptörleri arasındaki etkileşim bu virüsler için büyük ölçüde zor kalmıştır. Bu protokolü kullanarak viral nükleer protein, çift iplikli RNA arasındaki etkileşimi görselleştirebiliyor ve karakterize edebiliyoruz ve negatif anlamlı RNA virüsü için tek hücredüzeyinde bir PR'yi barındırabiliyoruz. Bu çift iplikçikli RNA ve bireysel hücrelerde iki viral veya konak protein hedefleri eşzamanlı boyama sağlayan bir multipleks tsay olduğunu. RNA-FISH tayininin aksine bu teknik RNA dizisi bağımsızdır ve genellikle protein hedeflerinin antikor tespiti ile uyumludur. Enfeksiyondan 24 saat önce 200,000 insan akciğer epitel A549 hücresini 12 kuyulu tabaklarda Poli-D-Lizin kaplı cam kapak lara koyup 37'de yetiştirerek başlayın
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtını tetiklemek amacıyla, RNA virüsü replikasyonu sırasında üretilen çift zincirli RNA'nın (dsRNA) örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından tanınmasını incelemektedir. Çalışma, düşük seviyeli dsRNA ile PRR'ler arasındaki etkileşimin henüz tam olarak anlaşılamadığı negatif anlamlı RNA virüslerine odaklanmaktadır. Tekil hücrelerde arenavirüs dsRNA ve PRR'lerini görselleştirmek için bir konfokal mikroskopi yöntemi geliştirilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünoloji
- Viroloji
Arka Plan
- Çift zincirli RNA, RNA virüsü replikasyonunun bir yan ürünüdür.
- Örüntü tanıma reseptörleri, doğal bağışıklık yanıtında kritik bir rol oynar.
- Negatif anlamlı RNA virüslerinde dsRNA ve PRR'ler arasındaki etkileşim yeterince anlaşılamamıştır.
- dsRNA ve PRR'lerin görüntülenmesi, viral bağışıklık sisteminden kaçış mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Negatif anlamlı RNA virüslerinde dsRNA ve PRR'ler arasındaki etkileşimi aydınlatmak.
- Bu etkileşimleri tekil hücrelerde görselleştirmek için bir yöntem geliştirmek.
- RNA virüslerine karşı gelişen doğal bağışıklık yanıtının anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- dsRNA ve PRR'lerin görüntülenmesi için konfokal mikroskopi.
- İmmün yanıtı değerlendirmek için hücresel analizler.
- Viral replikasyon sırasında dsRNA seviyelerinin analizi.
- Farklı RNA virüsleri ile karşılaştırmalı çalışmalar.
Ana Sonuçlar
- Tekil hücrelerde arenavirüs dsRNA ve PRR'lerin başarılı şekilde görüntülenmesi.
- dsRNA ve PRR'ler arasındaki spesifik etkileşimlerin belirlenmesi.
- dsRNA tarafından tetiklenen bağışıklık yanıt mekanizmalarına dair içgörüler.
- Viral patogenezde dsRNA'nın rolünün aydınlatılması.
Sonuçlar
- Geliştirilen konfokal mikroskopi yöntemi, dsRNA ve PRR etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Bu etkileşimlerin anlaşılması, RNA virüslerine karşı yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini sağlayabilir.
- Bu araştırma, viral immünoloji alanına geniş kapsamlı katkılar sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Negatif zincirli RNA virüsü enfeksiyonunda düşük bolluktaki çift zincirli RNA'nın (dsRNA) görselleştirilmesi, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunun ve viral bağışıklık kaçışının anlaşılmasındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu yetenek, örüntü tanıma reseptörlerinin (PRR) viral replikatif ara ürünlerle etkileşiminin doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak, antiviral keşif sürecinde hedef doğrulamayı ve mekanizmaya dayalı risk azaltmayı destekler. Yöntem, arenavirüsler ve ilgili patojenler için erken aşama hedef seçiminde öngörü güvenini artırarak, yüksek güvenlikli patojen programlarındaki portföy önceliklendirmesine bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Patojenik virüs modellerinde dsRNA-PRR etkileşimlerini tek hücre çözünürlüğünde görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Yolak netleştirmesi için multipleks protein boyamasıyla uyumlu, hassas ve diziden bağımsız bir tespit yöntemi sunar.
- Öngörücü Değer: İlgili enfeksiyon bağlamlarında ligand etkileşimini doğrulayarak PRR hedeflerinin biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Deney Hazırlığı: Deney standardizasyonu için dsRNA ve PRR kolokalizasyonunun kantitatif, uzamsal olarak çözümlenmiş çıktılarını üretir.
- Tarama Uygunluğu: Temel bağışıklık aktivasyon metriklerini belirleyerek, sonraki bileşik taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Platform Kullanımı: Antikor bazlı saptama ile uyumludur; görüntüleme iş akışlarında farklı viral hedefler ve konak proteinler genelinde yeniden kullanıma olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalıkla ilişkili sistemlerde dsRNA dağılımını ve PRR katılımını haritalandırarak, keşif gözlemlerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik İçgörü: İnnat immün sinyallezmenin uzaysal ve zamansal dinamiklerini açıklayarak, yolak modülasyonu için biyobelirteç seçimini bilgilendirir.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Yüksek patojenite modellerinde hedef etkileşiminin görsel onayıyla, veri odaklı devam/dur kararlarına olanak tanır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye ve ardından preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürecine, özellikle PRR yolaklarını hedefleyen immünomodülatör antivirüsallere yönelik olarak uyum sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Enfekte hücrelerde endojen ligand olarak dsRNA'yı görselleştirerek, PRR agonist/antagonist mekanizmalarının hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin dsRNA-PRR etkileşimleri üzerindeki etkilerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan, tekrarlanabilir ve kantitatif görüntüleme çıktıları sunar.
- Analizler: İmmün aktivasyon durumlarının yüksek içerikli analizi için multipleks floresan okumaları (dsRNA, viral protein, PRR) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Primer veya kök hücre türevli akciğer epitelyal modellerinde PRR aktivasyonunu doğrulayarak, in vitro gözlemleri preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Arenavirüslerin ötesinde, birden fazla negatif anlamlı RNA virüsü ve konak hedefine uygulanabilen standartlaştırılmış bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: PRR-ligand etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş konfokal protokoller ve hassas dsRNA tespiti aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Yolak modülasyonuna dair doğrudan görsel kanıtlar sağlayarak go/no-go karar kalitesini artırır ve geç aşama kayıplarını azaltır.
- Portföy Etkisi: Patojenik virüs bağlamlarında onaylanmış hedef etkileşimine dayalı olarak, immünomodülatör adayların risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Konfokal mikroskopi, immünofloresan boyama ve biyogüvenlik düzeyine uygun viroloji teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yüksek hassasiyetli dsRNA antikorlarına (örneğin, 9D5 klonu) ve uyumlu floresan görüntüleme altyapısına erişime bağlıdır.
- Tutarlı dsRNA sinyal kantifikasyonu ve kolokalizasyon analizi için laboratuvarlar arası standardizasyon gereklidir.
- dsRNA üretimi ve PRR ekspresyon seviyelerindeki hücre modeli değişkenliği (örneğin, A549'a karşı primer havayolu epitelyumu) dikkate alınmalıdır.
- Pratik sınırlamalar arasında potansiyel antikor çapraz reaksiyonları ve yüksek korumalı (BSL-3/BSL-4) ortamlarda optimizasyon ihtiyacı yer almaktadır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
