Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Viral vektörler, kusurlu genleri telafi etmek, önemli büyüme proteinlerini düzenlemek veya nöral devreleri izleyen işaretler üretmek için hücrelere genetik materyal imal edebilir. Sinir sistemine viral vektörler getirilmesi doğuştan gelen biyolojik engeller nedeniyle zordur. Omurilik dokusuna doğrudan enjeksiyon bu engelleri atlar, hücre organları veya sinapserişim için izin.

L1 ile L4 spinal düzeylerini doğru bir şekilde hedeflemek zor olabilir. Hedefi doğrulamak ve bu segmentlerin T11'den T13 omurlarına doğru iletiyi hatırlamak için yer işaretlerini kullanmak önemlidir. İşlem günü, enjektörü mikro pompaya takın ve mikro pompayı vernier ölçeğine sahip bir mikromanipülatöre yerleştirin.

Renkli bir boyayı cam iğnelerden birine dikkatlice yüklemek ve cam iğneyi enjektöre yerleştirmek için esnek bir iğneyle şırınga kullanın. Daha sonra iğnenin yıkıtakanların içine doğru şekilde tohumlandığını ve enjektör kapağının sıkıca vidalandığını ve çelik enjektör iğnesinin cam iğnenin uzunluğunun yaklaşık dörtte üçü kadar uzatıldığını doğrulayın. İşleme başlamadan önce, en az bir mikrolitre, artı dondurucu depolama enjeksiyon başına ekstra virüs küçük bir hacim çözülme, ve anestezili sıçanda parmak çimdik yanıt eksikliği onaylamak.

Kalçalardan hayvanın skapulae inferior açısına dorsal orta hat boyunca tıraş, daha kolay ve daha hassas bir tıraş için cilt gergin çekerek, ve sıralı 5% iyot ve% 70 etanol scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte. Her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Sonra steril bir bez üzerine hayvan yerleştirin ve herhangi bir idrar toplamak için mesane altına gazlı bez yerleştirin.

Deri kesiğinin yerini belirlemek için, L1 omurunu bulmak için son kaburgada parmakları hafifçe bastırın. Bir dönüm noktası olarak bu omur kullanarak ve neşter ile sıkıca bastırırken nazik yayılarak cilt gergin tutarak, kas ortaya çıkarmak için L1 sadece aşağı biten üç ila dört santimetre derili kesi yapmak için bir numara 10 cerrahi bıçak kullanın. Spinous süreçleri hissetmek için forseps ve makas kullanın.

Oda fare diş forceps ile bir üst süreç üzerine güvenli bir şekilde kapmak için izin vermek için küçük rostral kesim olun. Ve süreçlere mümkün olduğunca yakın iki uzun, derin kesik yapın. Yerinde lateral kasları güvence altına aldıktan sonra, kafalarının şeklini belirlemek için süreçleri etrafında kas temizleyin.

Daha sonra laminektomi bölgesini belirlemek için spinous süreçlerin başlarının şekillerini görselleştirin. T11 ve birebir T12 ve T13 süreçleri laminektomi nin yapıldığı yer olacaktır. Hedef alan doğru bir şekilde tespit edildikten sonra, intervertebral ligamentleri ortaya çıkarmak için omurları yavaşça yayın ve spinöz proseslerin küçük ısırıklarını ve omurların sırt yönüne sahip rongeurs kullanın.

Orta hat kan damarı görülebilir böylece orta hat kemik uzak kemik temizleyin, açıkça omurilik dokusu ortaya koyan bir pencere bırakarak ve enkaz ücretsizdir. Daha sonra stabilize forceps spinous süreçleri rostral ve kaudektomi penceresine bir omurilik tutucu hayvan güvenli tutmak için sabitlemek. Ve nefes alma hareketlerinin etkisini inkar etmek için hayvanın karnını kaldırın.

Virüsü enjektöre yüklemek için, pipet çözülmüş stokun yaklaşık beş mikrolitresini Parafilm parçasına yerleştirin ve cam iğneleri ucun içinde olacak şekilde yerleştirin. Saniyede 20 ila 100 nanolitre hızla en fazla dört mikrolitre virüs çekmek için mikro pompakullanın ve bloke olmadığından emin olmak için iğne ucundan virüs küçük bir miktar bırakmadan önce enjekte etmek için denetleyici ayarlayın. Herhangi bir fazla virüsü laboratuvar mendille silin ve mikromanipülatörleri yerleştirin, böylece vernier ölçeği görünür.

İğneyi omuriliğin orta çizgisine yerleştirin ve iğneyi yanal olarak 0,8 milimetre yönlendirmek için mikromanipülatördeki veronis ölçeğini kullanın. Sonra girintisi kadar omurilik akor için iğne indirin, ama delinme değil, dura, ve iğne ucu 1,5 milimetre derinliğe battı kadar iğne ile dura delmek için hızlı bir büküm hareketi kullanın. İğne yerleştirildikten sonra, enjektörü dakikada 400 nanolitre hızla virüsü teslim etmesi için programlayın ve virüsün boya nın ön kısmındaki ilerlemeyi gözlemleyerek omurilik akoruna girdiğini doğrulayın.

Enjeksiyon bittikten sonra, iğnenin virüsün yayılmasını kolaylaştırmak için iki ila beş dakika omurilikte dinlenmesine izin verin, bir sonraki enjeksiyon yerinde konumlandırma için iğneyi yavaşça geri çekmeden önce. Son enjeksiyondan sonra, lateral kas yaymak için kullanılan herhangi bir cihazların kaldırılmasına izin vermek için omurilik tutucu hayvan çıkarın. Sonra bir 4.0 kromik katgut sütür ile kas kapatın ve dokuz milimetrelik yara klipleri ile cilt zımba.

Başarılı bir enjeksiyondan dört hafta sonra, yan taraftaki torasik omuriliğin gri maddesi içindeki nöronlarda, enjeksiyona ipsilateral olarak anlamlı GFP ekspresyonu gözlenir. Beyaz maddede, GFP ekspresyonu ipsilateral kordondaki aksonlarda, özellikle propriospinal aksona özgü alanlarda gözlenir. Gri madde nöronların daha yüksek büyütme nöronal hücre organları ve dendritler tipik bir sinyal ekspresyonu bir örnek ortaya koymaktadır.

Nöronlarda GFP ekspresyonu da beyin sapı çekirdeklerinde görülebilir, pontin retiküler formasyon gibi. Başarılı bir omurilik enjeksiyonu prosedürü için önemli faktörler doğru vertebral hedefleme ve virüs doku ya giriyor sağlanması eğer bir rostral omurilik yaralanması bu işlemden önce yapılırsa, doğrudan enjeksiyon yaralanma etrafında bağlantıları yeniden nöronlar izlemek için kullanılabilir.