Woodboring Böceği uzantıları için Tarama ve İletim Elektron Mikroskobu Örnek Hazırlama Yöntemi

Woodboring böceği vücut yüzeyi sem her zaman serttir. Tween-20 fiksatif ve yıkama çözeltisi içine eklenir. TEM'de odun böceğinin vücut yüzeyi olan Tween-20, vücut duvarına fiksatif nüfuzu artırabilir ve vücuttaki doku ve organı daha iyi düzeltebilir.

Floresan mikroskop dilimleme doğruluğunu artırmak için yararlıdır. Bu teknik, vücut yüzeyinin yıkanması ve odun böceğinin vücut duvarına nüfuz etmek için yararlıdır. Böylece SEM ve TEM vizyonunu temizler.

Floresan mikroskop TEM'de dilimleme doğruluğunu artırmak için yararlıdır. Prosedürü gösteren Zhang Yanru, bizim laboratuvardan bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Chlorophorus caragana'nın yaşadığı bir bölgede, huni tuzağı nda isofhorone gibi bitki çekicilerle yemlenmiş alan tuzakları yerleştirin.

Tuzaklar içine woodboring böcek yetişkin çekin. Yetişkin Chlorophorus caragana temiz organları korumak 0.1 pH pBS başına mol 7.2, hacim glutaraldehit tarafından% 2.5 ağırlık, ve hacim Tween-20 tarafından% 0.06 hacim. Örneği üç gün boyunca dört santigrat derecede düzeltin.

Koruma sıvısından gövdeleri çıkarın ve PBS'de durulanın. Bir stereo mikroskop altında, uzantıları kaldırmak ve ultrasonik pbst 40 kilohertz onları temizlemek için forceps kullanın. 100 saniye boyunca temizlendikten sonra, temiz olup olmadığını kontrol etmek için numuneyi mikroskoba aktarın.

Hasar görmesini önlemek için 400 saniyeden uzun süre temizlemeyin. Daha sonra dehidratasyon gerçekleştirmek için 20 dakika boyunca konsantrasyonları bir dizi etanol örnekleri batırın. Dehidratasyon dan sonra, bir stereo mikroskop altında, ayrı ayrı üç gözlem yüzeyleri düzeltmek için karbon çift taraflı yapışkan bant kullanın, dorsal, ventral, ve lateral, saplamalar üzerine.

Tüm görüntüleme yüzeylerinin temiz ve kontaminasyondan arındırılmış olduğundan emin olun. Örnek aşamayı 48 saat boyunca silika jel kurutucu içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, bir iyon püskürtme aleti üzerinde, ana valfi açık konuma döndürün, numune haznesinin kapağını çıkarın ve numuneyi hazneye koyun.

Güç düğmesini açın ve hazır ışığın yandığından emin olun. Püskürtme süresini 45 saniye, kaplama kalınlığını ise 70.875 angstrom olarak ayarlayın. Mekanik pompa vakum kadran indeksi yedinin altına düştüğünde, deşarja basın ve platin püskürtmeye başlayın.

İşlemin sonunda, güç kaynağını kapatın ve numuneyi odadan alın. Sprey film kalınlığı D anvraz eşittir K kez V kez T.K fışkıran metal ve gaz tarafından belirlenen bir sabittir. Ben miliamperdeki plazma akışı, V ise kilovoltlarda uygulanan voltaj ve T saniye cinsinden zaman.

Örneği içeren saplamayı SEM'nin aşamasına takın. Örnek saplama ile örnek aşamasının iyi bir görüntü sağlamak için yeterli yüksekliğe sahip olduğundan emin olun. SEM yazılımını açın ve 20 kilovolt'dan başlayarak istediğiniz çalışma gerilimini seçin.

Yetişkin Chlorophorus caragana uzantıları elde ettikten sonra, üç saat boyunca bir ultrasonik banyoda PBST örnekleri yıkayın ve daha sonra 25 derece santigrat bir saat boyunca PBS hacim osmiyum tetroksit tarafından% 1 ağırlık onları düzeltmek. 50%60%70%85 %95 %100 ve oda sıcaklığında hacim etanol ile %100 hacimli 20 dakikalık ardışık tedaviler kullanarak numuneleri dehydrate. Forceps ile, düz bir gömme kalıp ısıtmalı rezorin uygulayın ve rezorin örnekleri gömmek.

Numunenin plakanın alt kısmında olduğundan ve gömme oluğun kenarına mümkün olduğunca yakın yerleştirildiğinden emin olun. Etiket ve daha sonra 72 saat boyunca 60 santigrat derece numune içeren plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve resenin polimerize olduğunu doğrulayın.

Örnek katıladıktan sonra, her reçine bloğunu floresan mikroskobun altına yerleştirin, mikroskobun floresan ışık kaynağını hareket ettirerek numuneyi yukarıdan gelen mavi ışıkla ışınlayın ve fotoğraflayın. Resin bloğundaki sensillanın açıkça görünür olduğundan emin olun. Sensillayı hedeflemek için rezorb bloğunun kenarı ile hedef sensörü arasındaki mesafeyi ölçün.

Palps SEM görüntü bakın ve kabaca hedef reseptöre yakın bir jilet ile rezorin bloğu kesti. Daha sonra, mavi ışık floresan mikroskopisi altında, sensilla net bir şekilde gözlenen böylece yukarıdan ışık kaynağı ayarlayın. Floresan mikroskobu aşamasına objektif mikrometreyi ekleyin.

Kabaca kesilmiş rezorb bloğunu fotoğraflayın ve ImageJ kullanarak hedef ile resenin kenarı arasındaki mesafeyi ölçün. Reçineler numunesini ultramikrotome yerleştirin ve hedef konuma ulaşına kadar 50 ila 60 nanometre kalınlığında kesin. Petri kaplarında formvar kaplı 100 örgü bakır ızgaralar üzerine bölümleri monte edin.

Oda sıcaklığında uranyl asetat doymuş filtrelenmiş çözeltisi ile ızgaraları lekeleyin. Işık kaynaklı çökeltileri engellemek için boyama sırasında bölümleri kapatın. 10 dakika boyunca leke.

Bir duman başlık, iki kez% 50 metanol, sonra iki kez filtrelenmiş gazdan arındırılmış suda durulayın. Plastik Petri yemeklerinin karelerine hazırlanmış kurşun sitrat lekesi damlaları yerleştirin ve sekiz dakika boyunca oturun. Gazdan arındırılmış filtrelenmiş suda durulayın ve kurulayın.

Izgaraları TEM makinesi içinde bir örnek aşamaya monte edin. Voltajı 80 kilovolt'a ayarlayın ve bölümleri inceleyin. Bu protokolde, Tween-20 ile temizlik ve fiksatif solüsyon kullanılarak, Tween-20 olmadan net bir SEM görüntüsü gözlenmiştir.

Glutaraldehit sabitleme solüsyonunun dokuya nüfuz etmesini sağlayan Tween-20 sabitleme solüsyonu ile TEM görüntüsünde mikrotübül yapıları açıkça görülürken, Tween-20 olmadan hazırlanan numunenin iç yapısı bulanıktı. Maksiller palps üzerinde tip bir sensilla dal basiconica peg sürekli kesitsel görünümler dendritik kılıf dış dendritik segmentleri çevrili ve uç gözenek genişletilmiş gösterdi. Yedi dalsız dış dendritik segmentleri bir dış kavite ile çevrili iç reseptör lenf boşluğu içinde vardı.

Boru gövdesi, her sensillar soket tabanındaki diğer dış dendritik segmentlerden dendritik kılıf ile ayrılmıştır. Siliyer bölgede, sekiz bipolar nöron varlığını gösteren farklı çaplarda sekiz dendrit tespit edildi. Bu teknik, tek hücreli kayıt veya yerinde hibridizasyon gibi sinirlerin işlevini daha fazla incelemek için kullanılabilir.