Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Bu protokolün amacı, yapay gözyaşı formülasyonlarının insan kornea epitel hücrelerini kurumaya karşı koruyup koruyamayacağını in vitro modelde değerlendirmektir. Bu yöntem, kuru göz semptomları olan kişiler için oküler korumaya yardımcı olabilecek kuru göz formülasyonlarının belirlenmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Bu test, kornea epitel hücresi metabolik aktivitesini tespit etmek için çok hassas bir ölçü kullanır.

Sonuç olarak, kurumaya bağlı olarak kornea hücre sağlığında küçük değişiklikler tespit edilebilir. Bugün prosedürü sergileyen Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran ve Adeline Suko olacak. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin içeren 20 mililitre DMEM/F12 ile kolajen kaplı şişelerde ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücrelerini büyüterek başlayın ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.

Hücreler neredeyse birleştiğinde, hücre kültürü ortamını çıkarın ve her şişeye dört ila altı mililitre hücre ayrışma ortamı ekleyin. Hücreleri ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin ve periyodik olarak mikroskop altında kontrol edin. Her şişeye% 10 FBS ile iki ila altı mililitre DMEM / F12 ekleyin ve içeriği 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 450 ila 500 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu bir hemositometre ile belirleyin ve 100.000 hücre içeren hacmi hesaplayın.

48 oyuklu, kollajen I kaplı bir kültür plakasının her bir oyuğuna, hesaplanan hücre hacmi ile birlikte ortam ekleyin ve her bir oyuktaki nihai hacmin 0,5 mililitre olduğundan emin olun. Daha sonra hücreleri 24 saat inkübe edin. Kontrol prosedürü için, kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri hemen 150 mikrolitre bir test formülasyonu veya ortam kontrol çözeltisi ile muamele edin.

Daha sonra hücreleri 30 dakika inkübe edin. Test solüsyonunu hücrelerden çıkarın ve 0.5 mililitre% 10 metabolik boya solüsyonu ekleyin. Hücreleri dört saat daha inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, her oyuktan 100 mikrolitre boya çözeltisini çıkarın ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Her kuyucuğun floresansını ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın, uyarımı 540 nanometreye ve emisyonu 590 nanometreye ayarlayın. Kurtarma prosedürünü gerçekleştirmek için, hücreleri daha önce açıklandığı gibi test çözeltileri veya kontrollerle inkübe edin.

Ardından her oyuğa 0,5 mililitre DMEM / F12 ortamı ekleyin. Hücreleri 18 saat inkübe edin. Ardından ortamı çıkarın ve metabolik aktiviteyi test edin.

Kontrol prosedürünü gerçekleştirmek için, kültür ortamını 48 oyuklu plakadaki hücrelerden çıkarın ve bunları hemen test formülasyonu veya ortam kontrol çözeltisi ile muamele edin. Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, test çözeltilerini hücrelerden çıkarın ve kuruması için beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 45 nem odasına koyun.

Daha sonra, 0.5 mililitre% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuktan 100 mikrolitre metabolik boya çözeltisini 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve floresansı ölçün. Kurtarma prosedürünü gerçekleştirmek için, daha önce açıklanan protokolü tekrarlayın ve kurutma adımından sonra DMEM / F12 ortamı ile 18 saatlik bir inkübasyon ekleyin.

Ardından, metin el yazmasında açıklandığı gibi veriler üzerinde istatistiksel analiz yapın. Üç kuru göz formülasyonu, insan kornea epitel hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri açısından karşılaştırıldı. Birinci ve ikinci çözeltiler, kurumadan önce hücrelerin metabolik aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahipti.

Birinci çözeltiye maruz kalan hücreler, 18 saatlik bir iyileşmeden sonra hücre metabolik aktivitesinde ek bir düşüş gösterdi, bu da başlangıçta yaralandıkları ve yaralanmanın onarılmadığı anlamına gelir. Buna karşılık, üçüncü çözelti, epitel hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerinde sadece hafif bir etkiye sahipti. Bu lipid içeren kuru göz formülasyonlarının hücreleri koruma kabiliyeti karşılaştırıldığında, birinci ve ikinci solüsyonların hücreleri kuruma stresinden korumadığı bulundu.

Ancak üçüncü çözüm, bir miktar koruma sağladı. Hücreleri kollajen kaplı plakalara ekerken, hücre süspansiyonunun, her bir oyuğun eşit hücre sayılarıyla tohumlanması için düzgün bir şekilde karıştırılmış hücreler içerdiğinden emin olun. Üçüncü çözüm, diğer iki lipid içeren ürüne göre hücre canlılığında ve kuruma stresinden korunmada istatistiksel olarak anlamlı bir iyileşme gösterdi.

HP-guar ve propilen glikol ile birlikte fosfolipidli mineral yağın, üçüncü çözeltinin kornea hücrelerine hidrasyon koruması sağlamasına ve kuruma altında buharlaşmayı azaltmasına izin vermesi mümkündür.