Farenin Ventral Tegmental Alanı İçinde Optogenetik Kullanarak İki Farklı Gerçek Zamanlı Yer Tercihi Paradigması
12 Şubat 2020
Burada farelerde optogenetik kullanarak yer tercihi paradigmaları için adım adım takip edilmesi kolay iki protokol salıyoruz. Bu iki farklı kurulumkullanılarak, tercih ve kaçınma davranışları, yüksek mekansal ve zamansal seçicilik ile aynı cihaz içinde ve basit bir şekilde sağlam bir şekilde değerlendirilebilir.
Burada belirli bir beyin bölgesinin genetik stimülasyon ödüllendirici veya aversive özelliklerini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Belirli hücrelerin uyarılması ödüllendirici veya aversive ise teknik hızla cevap verebilir. Ventral tegmental alanı uyarmak için kurulum tarif ama protokollerimiz kolayca farklı bölgeler açısından belirli parametreleri değiştirmek için adapte edilebilir okudu.
Başlamak için, lazer kaynağını kontrol etmek için tek kartlı mikrodenetleyiciler kullanın. Bilgisayara uygun bağlantı kablosunu kullanarak komut dosyasını mikrodenetleyici panosuna yükleyin. Komut dosyası, izleme yazılımından bir TTL kutusu aracılığıyla gelen dış modülasyon ve stimülasyon parametrelerini kontrol etmek için lazere bir çıkış içerir.
TTL kutusunu tahtaya bağlamak için bir ağ kablosu kullanın. Lazerin harici modülasyon la kontrol edilebilmesi için ayarlandığından emin olun ve lazeri FC/PC kablosu kullanarak tahtaya bağlayın. Uygun pimleri tahtanın zemin parçalarına bağlayın.
Lazer kaynağını optik fibere bağlamak için, önce lazer kaynağını döner bir derkiye bağlayın. Bir yama kablosunu döner derkiye bağlayın. Döner dergiyi cihazın üzerinde, ancak kayıt alanının dışında sabitle.
Fiber optik yama kablosunun uzunluğunun, farenin arenada zorluk olmadan hareket etmesine izin vermek için uygun olduğundan emin olun. Arena kurulumayarlamak için, fiziksel cihazın belirli bir bölümünü ölçmek için bir cetvel kullanın. Yazılımda, ölçülen parçaya karşılık gelen bir çizgi çizin.
Kalibrasyon sekmesine Ayarla Ölçeği'nin altında, zaten bilinen değeri girin. Arenayı tasarla, farelerin hareketinin kaydedeceği alanı çiz. Bölgeleri oluşturun, sonunda lazer eşli, lazer leeşmemiş ve nötr olarak atanacak bölgeleri çizin.
Örneğin, arenanın dışındaki bölgeler gibi çakışan bir parametre olmadığını doğrulamak için kurulumu doğrulamak için Kurulumu Doğrula düğmesine basın. Donanım denetiminin etkin olduğundan emin olun ve denemenin saatini başvuru kutusu ayarlarındaki yineleme til seçeneğine göre 30 dakika olarak ayarlayın. Faregirişinin izleme yazılımı aracılığıyla mikrodenetleyici panosuna koşul ayarları altında TTL sinyalini tetikleyeceği lazer eşli olarak bir bölme atayın.
Nötr bölme tercihi yaklaşımının kurulumunu değiştirmek için, arena ve zaman kurulumundan sonra, a ve b bölmelerinin ayarlarıyla ilgili koşul kutusu için merkez noktası A ve bölge B'den herhangi birinde yken eklenerek hem A hem de B bölgelerini lazer le eşlenmiş olarak atayın. Algılama ayarlarını ayarlamak için fareye benzemek için bir kukla kullanın. Kuklayı aygıtın bir bölmesine yerleştirin ve dinamik çıkarma ile otomatik kurulum kullanın.
Kuklayı çıkarın ve karşı bölmeye yerleştirin. Kuklanın tam olarak tespit edildikinden emin ol. Kuklayı lazerle eşleştirilmiş bölmeye yerleştirin.
Uyarım işe yarayıp yaramadığını kontrol etmek için, önceden yapılandırılmış deneme denetimi ayarlarını kullanarak edinmeye başlayın ve uyarımın olması gerektiği gibi tetiklenip tetiklenmeyişe bak. Daha sonra mankeni eşleşmemiş veya nötr bölmeye yerleştirin ve uyarımDurdurulup durdurulmamadığına bakın. Lazer gücünü 10 miliwatt'a ayarlamak için lazerin üzerindeki bilemiyi kullanın.
Fiber optik implantı seramik bir kılıf kullanarak fiber optik yama kablosuna bağlayın ve fareyi üç bölmeli aparatın nötr bölmesine yerleştirin. Fare yazılım tarafından algılanana kadar bekleyin. Hayvanın ana bölmelere girmesini kısıtlayan dikey sürgülü kapıları çıkarın.
Hayvanın herhangi bir rahatsızlık duymadan özgürce keşfetmesine izin verin. Tüm gerçek zamanlı yer tercihi denemesi sekiz oturum boyunca gerçekleşir. Ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP virüsü enjekte edilen DAT-Cre farelerdopaminerjik nöronları hedef almak için test edildi.
Fareler, %20'lik eşleşmez bölmenin ve %10'luk nötr kompartmanın aksine, zamanlarının ortalama %70'ini ventral tegmental bölgede AAV channelrhodopsin EYFP enjekte edilen Vglut2-Cre farelerile gözlenmiştir. Fareler, stimülasyonla eşleşen bölmeden kaçındı ve eşleşmemiş bölmede daha fazla zaman geçirdi. Koşullu tepkiler gün beş ve sekiz sırasında, fareler daha önce eşleştirilmiş bölmesi net bir kaçınma göstermedi.
Belirli nöronların ödüllendirici veya aldatıcı rolünü daha fazla göstermek için, açıklanan yöntem operon paradigmaları veya fotogenetik substimülasyon gibi diğer yöntemlerle iltifat edilebilir. Virüsleri kullanırken ve lazer kaynaklarını kullanırken dikkat edin.
Genel Bakış
Bu makale, farelerde optogenetik kullanan ve yüksek uzamsal ve zamansal seçicilikle tercih ve kaçınma davranışlarının değerlendirilmesine olanak tanıyan iki yer tercihi paradigması protokolü sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Analiz
- Optogenetik
Arka Plan
- Beyin stimülasyonunun ödüllendirici ve itici özelliklerini anlamak nörobilimde büyük önem taşır.
- Optogenetik, nöronal aktivitenin hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
- Stimuluslara verilen davranışsal yanıtları değerlendirmek için genellikle yer tercihi paradigmaları kullanılır.
- Bu çalışma, ventral tegmental alan ve bunun ödül işlemedeki rolüne odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Optogenetik stimülasyonun fare davranışı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için protokoller geliştirmek.
- Spesifik nöronal stimülasyonun tercih ve kaçınma üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Farklı beyin bölgelerine uyarlanabilen esnek bir düzenek sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Lazer stimülasyonunu kontrol etmek için tek kartlı mikrodenetleyicilerin kullanımı.
- Fare hareketlerinin doğru takibi için deneysel arenanın kalibrasyonu.
- Stimülasyonu fare davranışı ile senkronize etmek için TTL sinyallerinin uygulanması.
- Farklı fare genotipleriyle birden fazla oturum boyunca davranışsal yanıtların değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- DAT-Cre fareleri, zamanlarının %70'ini orada geçirerek lazerle eşleştirilmiş bölmeye karşı bir tercih göstermiştir.
- Vglut2-Cre fareleri, lazerle eşleştirilmiş bölmeden kaçınma davranışı sergilemiştir.
- Davranışsal yanıtlar, farklı test günleri arasında farklılık göstermiştir.
- Yöntem, daha fazla doğrulama için diğer tekniklerle tamamlanabilir.
Sonuçlar
- Protokoller, spesifik nöronal stimülasyonun davranış üzerindeki etkilerini incelemek için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Sonuçlar, genetik arka plana bağlı olarak belirgin davranışsal fenotipler olduğunu göstermektedir.
- İlerideki araştırmalar, ek metodolojiler kullanarak bu bulguları genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Nöronal stimülasyonun ödüllendirici veya itici özelliklerinin değerlendirilmesi, nörobilim odaklı ilaç keşfinde hedef doğrulama için kritik öneme sahiptir. Gerçek zamanlı yer tercihi paradigmaları, spesifik nöral devrelerin hızlı ve nedensel bir şekilde sorgulanmasına olanak tanıyarak terapötik hipotezlerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Bu yaklaşım, erken keşif iş akışlarındaki devam/dur kararlarını bilgilendiren kantitatif davranışsal çıktılar sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Belirli bir nöron popülasyonunun stimülasyonunun ödül veya averzi fenotipleri oluşturup oluşturmadığının nedensel olarak test edilmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Hipotez sorgulamasını desteklemek için yüksek zamansal çözünürlüğe sahip, gerçek zamanlı ve kantitatif davranışsal çıktılar sağlar.
- Öngörücü Değer: Nöronal aktivasyonu, nöropsikiyatrik endikasyonlarla ilgili ölçülebilir davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek hedef güvenilirliğini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Deney Hazırlığı: Optogenetik stimülasyon kullanarak nöromodülatör hedeflerin taranması için standardize edilmiş, tekrarlanabilir bir davranışsal deney düzenek oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Genotipler veya koşullar genelinde stimülasyon etkilerini değerlendirmek için bağımlı değişkenler olarak hizmet eden bölmede-geçirilen-süre metrikleri üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Protokol, farklı beyin bölgelerine ve stimülasyon parametrelerine uyarlanabilir, böylece farklı hedeflerin tarandığı kampanya çalışmaları yürütülmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: Ventral tegmental alan stimülasyonu, ödül ile ilişkili bozukluklar ve bağımlılık tedavileriyle ilgili olan mezolimbik yolak fonksiyonunu modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Gerçek zamanlı davranışsal çıktılar, akut nöromodülasyon çalışmaları ile daha uzun süreli koşullu yer tercihi değerlendirmeleri arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Doğrudan nöronal etkileri kompansatuar ağ yanıtlarından ayırt etmeye yardımcı olarak hedef mekanizmadaki belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, devre düzeyindeki hedef doğrulamanın, öncü bileşik tanımlaması ve preklinik etkinlik testlerinden önce geldiği keşif biyolojisi aşamasına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Belirli nöronların optogenetik aktivasyonunun ödül veya kaçınma davranışlarını tetikleyip tetiklemediğini belirleyerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Farklı genetik veya farmakolojik koşullar altında nöromodülatör hedeflerin değerlendirilmesi için analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Analitik: Stimülasyon etkilerinin istatistiksel karşılaştırması için nicel bağımlı değişkenler (lazerle eşleştirilmiş, eşleştirilmemiş ve nötr bölmelerde geçirilen süre) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Akut nöronal stimülasyon etkilerini, ödül işlemenin preklinik modelleriyle ilgili davranışsal fenotiplerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çerçeve, laboratuvarlar arasında standart hale getirilebilir ve çeşitli beyin bölgelerine uyarlanabilir; böylece nörobilim keşiflerinde platform düzeyinde yeniden kullanımdır teşvik edilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöronal nedenselliğe ilişkin mekanistik içgörü sağlayarak hedef seçimindeki yanlış pozitifleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Otomatik takip ve gerçek zamanlı stimülasyon kontrolü ile yüksek kapasiteli davranışsal değerlendirmeye olanak tanır.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyon stratejilerine olan güveni artırarak, erken keşif aşamasındaki kaynak tahsisini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Devreye özgü etkilerin davranışsal doğrulamasına dayanarak, hedeflerin risk odaklı önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Hassas nöronal hedefleme için optogenetik, viral vektör iletimi ve stereotaksik cerrahi konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikrokontrolörler, lazerler, döner eklemler, fiber optikler ve davranış izleme yazılımlarını içeren entegre donanıma bağımlıdır.
- Tutarlı kurulum ve kalibrasyon için nörobilim, mühendislik ve veri analizi grupları arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Denekler arasındaki opsin ekspresyonu, fiber yerleşimi ve lazer gücü iletimindeki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Akut davranışsal etkilerle sınırlıdır; tamamlayıcı boylamsal çalışmalar olmadan kronik adaptasyonu veya kompanse edici mekanizmaları değerlendirmez.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
