Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

İnsan pluripotent kök hücrelerinde genlerin düzenlenmesi zordur. Bu protokol, hedefleme vektörü ile birlikte eşleştirilmiş Cas-90 vakası kullanılarak bu hücrelerde genom düzenleme için ayrıntılı prosedür sağlar. Güvenilir ve takip etmesi kolaydır.

Bu protokolün temel avantajı, kesintisiz genomik düzenleme olmasıdır. İki aşamalı seçim, hedeflenen hücrelerin arttırılmasına yardımcı olur ve genotipleme taramasını daha verimli hale getirir. İnsan pluripotent kök hücrelerini mTeSR1 ortamında rekombinant laminin 21 kodlu yüzeylerde muhafaza edin.

Hücreler, bir ila üç bölünme oranından 72 saat sonra% 70 ila 85 birleşmeye ulaşmalıdır. Transfeksiyon gününde, 300 mikrolitre laminin 521 çözeltisi ile 24 oyuklu bir plakanın yeterli miktarda kuyusunu kaplayın ve plakayı en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kaplama çözeltisini nazikçe çıkarın ve hemen her bir oyuğa 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 300 mikrolitre taze mTeSR1 ortamı ekleyin.

Sonra plakayı tekrar inkübatöre koyun. Stok insan pluripotent kök hücrelerini inkübatörden çıkarın. Kullanılmış ortamı çıkarın ve hücreleri bir mililitre steril DPBS ile bir kez yıkayın.

Daha sonra her bir oyuğa bir mililitre yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri ayırmak için altı ila sekiz dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin kolayca ayrılabildiğinden emin olmak için plakaya hafifçe vurun. Ardından, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek kaldırmak için bir P1000 ucu kullanın.

Ayrışmayı sonlandırmak için ROCK inhibitörü ile iki mililitre mTeSR1 ortamı ekleyin. Süspansiyonu iyice karıştırın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri ROCK inhibitörü ile iki mililitre mTeSR1 ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Her nükleofeksiyon reaksiyonu için 800.000 ila 1 milyon hücreyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.

Sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin. İnsan kök hücre nükleofeksiyon kitinden 100 mikrolitre karışık nükleofeksiyon çözeltisi içinde eşleştirilmiş Cas-9n tek kılavuz RNA ekspresyon plazmitlerinin üç mikrogramını ve beş mikrogram hedefleme vektör plazmitini karıştırın. Bir GFP kontrol plazmid karışımı da hazırlayın.

Hücreleri DNA karışımı ile yeniden süspanse edin ve hava kabarcıklarını önlemek için bir elektroporasyon küvetine aktarın. İnsan pluripotent kök hücreleri için optimize edilmiş koşulu kullanarak hücreleri nükleofeksiyon cihazı ile elektropoze edin. Elektroporasyonlu hücrelere hemen 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze ve ılık mTeSR1 ortamı ekleyin.

Daha sonra karışımı önceden hazırlanmış 24 oyuklu plakanın iki kuyucuğuna aktarın. Hücrelerin iyileşmesini sağlamak için plakayı% 5 karbondioksit ile sağlanan 37 santigrat derece inkübatöre koyun. Hücre bakım ortamını 12 ila 16 saat sonra değiştirin, hücreler hücreden hücreye temas kurarsa ROCK inhibitörünü geri çekin.

24 ila 48 saat sonra, kontrol hücrelerinde GFP ekspresyonunu inceleyerek nükleofeksiyon verimliliğini kontrol edin. Nükleofeksiyondan 48 saat sonra, mTeSR1 ortamını mililitre puromisin başına bir mikrogram ile takviye ederek hücreleri seçmeye başlayın. 72 saat sonra, ortamı mililitre puromisin başına 0.5 mikrogram ile destekleyin.

Hücre birleşmesi% 30'dan düşükse, ortamı 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile de destekleyin. Nükleofeksiyon geçişinden dört ila altı gün sonra, puromisine dirençli hücreler, kuyucuk başına 0.8 hücre konsantrasyonunda 10 ila 15 96 oyuklu plakaya. Ortamı ROCK inhibitörü ve puromisin ile takviye ettiğinizden emin olun.

Tek hücreli türetilmiş koloniler oluşturmak için hücreleri 10 ila 12 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksitte tutun. Tohumlamadan yedi gün sonra ortamı doldurun. Tek bir koloni içeren kuyucukları işaretleyin ve ortamı, mililitre puromisin başına 0.5 mikrogram içeren, ancak ROCK inhibitörü içermeyen taze mTeSR1 ortamı ile değiştirin.

Hücreleri iki gün daha 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte büyütün. Daha sonra farklılaşmamış koloniler içeren kuyular için ortamı değiştirin. Kolonileri nazikçe sıyırın ve hücre süspansiyonunu bir koloniden ayrı 96 kuyucuklu plakalar üzerindeki iki yeni kuyuya aktarın.

Biri genotipleme için, diğeri bakım için. Genotipleme hücrelerinin birleşmesi% 50 veya üzerine ulaştığında, harcanan ortamı boşaltın ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın. Hücreleri Bradley Lysis Buffer ile parçalayın ve her kuyucuktan genomik DNA'yı izole edin.

Üç primer bağlantı PCR gerçekleştirdikten ve ürünleri sıraladıktan sonra, kolonileri doğru genotiple tutun ve geri kalanını atın. Sürekli puromisin seçimi altında doğru kolonileri genişletin ve mümkün olan en erken geçişte dondurun. Bu protokol, hepatosit nükleer faktör dört alfa geninin Ekson8'ine iki nokta mutasyonu eklemek için kullanıldı.

Doğru hedeflenmiş hücreleri taramak için üç primer tabanlı bir PCR yöntemi kullanıldı ve PCR sonuçlarını doğrulamak için Sanger dizilemesi yapıldı. Seçim kasetinin çıkarılmasından sonra, istenen nokta mutasyonlarının doğru şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için modifiye edilmiş bölge tekrar sıralandı. Doğru genotipe sahip koloniler seçildi ve hücreler daha fazla analizden önce karakterize edildi.

Düzenlenen hücreler, ebeveyn hücrelerle aynı morfolojiye sahiptir ve transkripsiyon faktörleri Nanog ve Oct4'ün yanı sıra hücre yüzeyi belirteçleri, SSEA-4 ve TRA-160 dahil olmak üzere temsili insan pluripotent kök hücre belirteçlerini eksprese eder. Bu prosedürü denerken, ilk 24 saat boyunca puromisin seçiminden sonra hücre birleşmesini kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Medyanı ROCK inhibitörü ile takviye etmek esastır.

Hücre birleşmesi %30'dan düşüksehücrelerin devam etmesini sağlamak için. Genom düzenlenmiş pluripotent kök hücre hatları oluşturulduktan sonra, gen fonksiyonunu veya yönlendirilmiş farklılaşmayı incelemek için kullanılabilirler. Bu teknik, araştırmacıların genlerin spesifik işlevi veya genetik hastalık için hedeflenen gen düzeltmesi gibi farklı soruları incelemelerinin yolunu açıyor.