In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması
9 Haziran 2020
Bu protokol, kalp hastalıkları için hücre implantasyon tedavisinin araştırılmasına olanak sağlamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyovasküler hücreleri içeren mesh şeklinde tasarlanmış kardiyak dokular üreder.
Bu protokol, insan kaynaklı vücut parçaları ve STEM hücre kaynaklı kalp hücrelerinden elde edilen örgü şeklinde tasarlanmış kardiyak dokular oluşturmak için asil ve kolay bir yöntem açıklar. Doku geometrisinin esnekliği ve korunmuş doku fonksiyonunun ölçeklenebilirliği bu tekniğin başlıca avantajlarıdır. İmplante örgü şekli ECT'ler bir sıçan miyokard infarktüsü modelinde kardiyak yapı ve fonksiyon geri yükleyebilirsiniz.
Kardiyak rejeneratif tedavide kullanım için fizibilitesini teyit. Bu teknikler tutarlı sonuçlar için tekrarlanabilir insan KÖK hücre işleme ve doku kültürü becerileri gerektirir. Sancaklı pozisyonlarda yedi milimetre uzunluğunda 0,5 milimetre genişliğinde ve 2,5 milimetre yüksekliğinde dikdörtgen direkler ile 21 tarafından 20,5 milimetrelik dikdörtgen tepsi imal etmek için sac silikon yapıştırıcı ile yapıştırılmış izin vermek için uygun boyutta bir kürlenmiş PDMS levha keserek başlayın.
İki satır lık mesaj arasındaki yatay aralık 2,5 milimetre olmalıdır. Tepsiyi 120 santigrat derecede 20 dakika boyunca otoklavlayın ve kalıbı pbs'de bir saat boyunca %1 Poloxamer 407 ile kaplayın. Daha sonra kalıbı PBS ile iyice durulayın ve kalıbı altı kuyulu bir tabak kuyuya yerleştirin.
Soy analizi için, kardiyomiyosit artı endotel ve vasküler duvar hücre protokolleri hücreleri birleştirmek. Böylece duvar hücrelerinin son konsantrasyonu, yapı başına altı hücreye altı kat 10'luk bir toplam hücre sayısının %10 ila %20'si kadardır. Mix 133 asit çözünür Sıçan Kuyruğu kollajen tip bir çözelti ve 17 mikrolitre Alkali Tampon 17 mikrolitre 10X Minimum Essential Medium buz üzerinde.
Sonra kollajen çözeltisi için Bodrum Membran Matrix 67 mikrolitre ekleyin. Sonra, hücreleri santrifüj ve fetal sığır serum ve antibiyotikler ile desteklenen Yüksek Glikoz Dulbecco Minimal Essential Medium 167 mikrolitre pelet resuspend. Matris çözeltisindeki hücreleri buz üzerinde karıştırın.
Daha sonra dikkatlice poloxamer 407 kaplı PDMS doku kalıbına hücre matris süspansiyon 400 mikrolitre dökün. Standart hücre kültürü kuvözdeki hücre matris karışımını 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 60 dakika kuluçkaya yatırın. Doku oluştuğunda, dikkatle EKT kültür orta dört mililitre ile kalıp ıslatın ve 14 gün boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek.
EKT implantasyonundan önce, EKT'yi yükleme direklerinden dikkatlice çıkarmak için ince prömiyerleri sterilize ettiniz. Doku kalıpları farklı son EKT geometrileri oluşturmak için çeşitli desenler, post uzunlukları ve sonrası aralıkları ile imal edilebilir. Bu analiz için, 2,5 milimetre genişliğinde aralıklarla yedi milimetre uzunluğunda direkler ile bir kalıp kullanılmıştır.
Poloxamer 407, hücrelerin kalıba yapışmasını önler ve 14 gün içinde hızlı jel sıkıştırmasını takiben karakteristik bir örgü yapısının oluşmasını sağlar. EkT kalıptan çıktıktan sonra bile yapı korunur. Fabrikasyon doku yapısı yaklaşık 1,5 santimetre genişliğinde ve 0,5 milimetre kalınlığındadır.
Ve kafesteki her bir demet genişliği ortalama olarak yaklaşık 0,5 milimetredir. Aynı şaşırtıcı post tasarımı ile dört kat daha büyük bir kalıptan 24 milyon hücre içeren 3 santimetrelik son genişlikte bir mesh ECT oluşturmak mümkündür. Bu büyük kafes EKT de kolayca kalıp kaldırılabilir ve küçük örgü EKT eşdeğer kuvvet yerel bir hareket oluşturur.
Bu son jel duygu kusurları önlemek için kabarcıklar üretmeden doku kalıbına eşit hücre matris karışımı dökmek önemlidir. Yüklenicinin işlevsel karakterizasyonu. ve dördüncü frekans ilişkileri dahili sistemler kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Nihai hedefimiz, EKT paradigmalarının büyük hayvan klinik öncesi çalışmaları kullanan klinik tedavilere çevrilmesidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, insan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen ağ şeklinde mühendislik ürünü kardiyak dokuların oluşturulması için yeni ve kolay bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu teknik, özellikle bir sıçan miyokard enfarktüs modelinde, kalp hastalıkları için hücre implantasyon terapisinin araştırılmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak doku mühendisliği
- Kök hücre tedavisi
- Rejeneratif tıp
Arka Plan
- Mühendislik ürünü kalp dokuları, kalp yapısını ve fonksiyonlarını geri kazandırabilir.
- İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler, kalp hücresi türetimi için değerli bir kaynaktır.
- Doku geometrisinin esnekliği, etkili implantasyon için kritik öneme sahiptir.
- Kök hücre işlemedeki tekrarlanabilirlik, tutarlı sonuçlar elde etmek için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Ağ şeklinde mühendislik ürünü kardiyak dokular oluşturmak için bir yöntem geliştirmek.
- Bu dokuların kardiyak rejeneratif terapideki uygulanabilirliğini değerlendirmek.
- İmplantasyon sonrası kardiyak fonksiyonun geri kazanımını incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS ve silikon yapıştırıcı kullanılarak dikdörtgen bir tepsi imalatı.
- Mühendislik ürünü dokuları desteklemek için destek sütunlarının oluşturulması.
- Mühendislik ürünü kardiyak dokuların bir sıçan modeline implantasyonu.
- Kardiyak yapı ve fonksiyon restorasyonunun değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Ağ şeklindeki mühendislik ürünü kardiyak dokular, kalp fonksiyonlarını başarıyla geri kazandırmıştır.
- Yöntem, doku geometrisinde ölçeklenebilirlik ve esneklik göstermiştir.
- Tekrarlanabilir kök hücre işleme yoluyla tutarlı sonuçlar elde edilmiştir.
- Teknik, kardiyak rejeneratif terapide kullanım için uygundur.
Sonuçlar
- Bu protokol, mühendislik ürünü kardiyak dokular oluşturmak için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Ağ şeklindeki dokular, bir miyokard enfarktüsü modelinde kardiyak fonksiyonu etkili bir şekilde geri kazandırabilir.
- Bu yaklaşım, gelecekteki kardiyak rejeneratif tedaviler için gelecek vaat etmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Bu protokol, insan iPSC türevli kardiyovasküler hücrelerden ağ şeklinde mühendislik ürünü kalp dokularının ölçeklenebilir üretimini sağlayarak miyokard onarım stratejileri için tekrarlanabilir bir platform sunar. Bu yaklaşım, rejeneratif kardiyolojideki kritik bir boşluğu doldurarak, iskemik hasar modellerinde doku entegrasyonunun ve fonksiyonel restorasyonun preklinik değerlendirmesini destekler. Geometrik olarak ayarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yapı sağlayarak, kalp yetmezliği için kök hücre tabanlı tedavilerin translasyonel risklerinin azaltılmasını kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: hiPSC kaynaklı kardiyak hücrelerin in vivo yapısal ve fonksiyonel entegrasyonunu değerlendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Çalışmalar arasında tutarlı preklinik sonuçlar elde etmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir doku formatı sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel analiz geliştirme için nicelleştirilebilir yapısal metrikler (örneğin, miyofiber demeti hizalanması, senkronize kontraksiyon) üretir.
- Operasyonel Değer: Doz-yanıt ve parti tutarlılığı testlerine olanak tanıyan, daha büyük konstrüktlara (3.0 cm'ye kadar) ölçeklenebilirliği destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Bir sıçan miyokard enfarktüsü modelinde kardiyak yapı ve fonksiyonun geri kazandırılmasının fizibilitesini kanıtlayarak mekanistik risk azaltımını destekler.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış implantasyon ve fonksiyonel değerlendirme iş akışları aracılığıyla keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, ağ şeklindeki ECT'leri keşiften preklinik aşamaya bir köprü olarak konumlandırarak, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir doku üretimi aracılığıyla erken keşif aşamasında hipotez testine ve preklinik aşamalarda fonksiyonel doğrulamaya olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: hiPSC kaynaklı kardiyak hücre entegrasyonunun ve elektromekanik fonksiyonun kontrollü değerlendirmesini sağlayarak, yolakların netleştirilmesini ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Bileşik veya durum karşılaştırmaları için ölçülebilir çıktılara (atım senkronizasyonu, hizalanma) sahip, analize hazır ve standardize edilmiş dokular sunar.
- Analitik: Deneysel gruplar arasında karşılaştırmalı analizi mümkün kılmak için yapısal ve fonksiyonel veriler (konstrükt boyutları, miyofiber çapı, kontraksiyon senkronizasyonu) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: İn vitro olgunlaşmadan in vivo fonksiyonel restorasyona kadar süreklilik sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli geometrilere ve ölçeklere uyarlanabilir bir platform teknolojisi oluşturarak, projeler arası tekrarlanabilirliği ve kaynak verimliliğini teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kök hücre tutunması ve kardiyak onarıma fonksiyonel katkıdaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış hücre oranları, matriks formülasyonu ve kalıp geometrisi aracılığıyla standardizasyon ve ölçeklenebilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Tekrarlanabilir preklinik etkinlik verileri sağlayarak geç aşama biyolojik riskleri azaltır ve devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış doku performansı ve ölçeklenebilirliğe dayalı olarak, kardiyak rejenerasyon adaylarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- İnsan iPSC diferansiyasyonu, kardiyovasküler hat belirleme ve 3D doku kültürü teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- PDMS kalıplama ekipmanına, sterilizasyon olanaklarına ve matriks-hücre karıştırma işlemi için hassas sıvı transferine erişime bağlıdır.
- Gruplar arası tutarlılığı sağlamak amacıyla hücre temini, matriks hazırlama ve inkübasyon protokollerinin ekipler arası standartlaştırılması gereklidir.
- Özellikle besin difüzyonu ve elektriksel kenetlenme açısından, daha büyük yapılara veya alternatif geometrilere ölçeklendirme sırasında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Fonksiyonel doğrulama için mevcut kemirgen modellerine olan bağımlılıkla sınırlıdır ve klinik çeviri için daha büyük preklinik sistemler gerektirir.
