Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri
24 Mayıs 2020
Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.
Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri, çok sayıda genetik temelli vektör kontrol aracının geliştirilmesine zemin hazırlamıştır. Çok sayıda böcek türü halihazırda iyi geliştirilmiş protokollere sahip olsa da, Culex quinquefasciatus nispeten az çalışılmıştır. Bu mikroenjeksiyon protokolü, yumurta toplama, yumurta sal ayırma ve enjeksiyon sonrası prosedürler dahil olmak üzere Culex quinquefasciatus'un benzersiz biyolojik özelliklerini barındırmak için özel olarak tasarlanmıştır.
Bu yöntem muhtemelen ilgilenilen herhangi bir Culex türüne uyarlanabilir ve gen fonksiyonunu incelemek veya Culex türleri için genetik tabanlı kontrol teknolojileri oluşturmak için kullanılabilir. Yumurtaları sallardan ayırarak başlayın. Salın üzerine bastırmak için forseps veya boya fırçası kullanın ve tek tek yumurtaları ayırın.
Yumurtaları, bir cam sürgünün üst kısmına yerleştirilmiş ince bir çift taraflı yapışkan bant şeridi üzerine hizalayın ve her bir yumurtanın ön tarafını aynı yöne doğru yönlendirmeye çalışın. Halokarbon reaktiflerini suyla hafifçe karıştırarak ve karışımı gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe ederek halokarbon karışımını hazırlayın. Hizalanmış yumurtaları halokarbon yağ karışımı ile örtün.
Mikroenjeksiyonlar için iğneler oluşturmak için, üreticinin talimatlarını izleyerek bir alüminosilikat kılcal camı bir iğne çekiciye yerleştirin. Isıyı 560'a, hızı 100'e, gecikmeyi 70'e, çekmeyi 97'ye ve basıncı 500'e ayarlayın. Ardından iğne çekiciyi etkinleştirin.
İğne ucunu eğim vermek için çekilen iğnenin ucuna dönen elmas aşındırıcı plaka üzerinde 50 derecelik bir açıyla yaklaşık 10 saniye boyunca hafifçe dokunun. Çekilmiş ve eğimli iğneleri bir petri kabındaki modelleyici kil çizgilerine gömün. Genom modifikasyon reaktiflerinden oluşan enjeksiyon karışımını hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
Enjeksiyon iğnesine iki mikrolitre enjeksiyon karışımı yüklemek için bir mikro yükleyici ucu kullanın. Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini elektronik bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin ve hizalanmış yumurtalarla birlikte cam slaytı bir bileşik mikroskop tablasına yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi embriyonun arka ucunu 25 ila 35 derecelik bir açıyla hedefleyecek şekilde hizalayın.
İğneyi dikkatlice embriyoya yerleştirin ve karışımı embriyo hacminin yaklaşık% 10'u kadar bir miktarda enjekte edin. Bir seferde 20 yumurta enjekte edin, ardından durdurun ve embriyo kurtarma prosedürlerini gerçekleştirin. Enjeksiyondan sonraki 20 dakika içinde, halokarbon yağını yumurtalardan temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalayarak dikkatlice çıkarın.
Yumurtaları boya fırçası ile kaldırın ve yumurtaları yüzeyde tutmaya özen göstererek bir bardak çift damıtılmış suya koyun. Önümüzdeki yedi gün boyunca, yumurtaları kuluçka için günlük olarak kontrol edin ve normal larva yetiştirme prosedürlerini izleyin. Enjekte edilen sivrisinekleri bir stereoskop kullanarak mutant fenotipler için tarayın.
Bu yöntem, koyu göz pigmentasyonunun gelişimi için kritik olan bir genin somatik ve germ hattı mutasyonlarını başarılı bir şekilde oluşturmak için kullanılmıştır. CRISPR-Cas9 tarafından oluşturulan somatik mutasyonlar, enjekte edilen bireylerin pupil evre gözlerinde pigmentasyon kaybı taraması yapılarak puanlandı. Somatik mutasyonlar genellikle mozaik fenotipler olarak mevcuttu, burada hücrelerin tamamı olmasa da bazıları mutant fenotipe sahipti.
Germ hattı mutasyon oranları, mozaik G sıfır bireylerin çaprazlanması ve tamamen beyaz gözlü yavru başına puanlama ile belirlendi. Bu deneyler, %64 ila 82'lik bir embriyo sağkalım oranı, %37 ila 57'lik bir somatik mutajenez oranı ve %61'den fazla germline mutajenez oranı ile sonuçlandı. Aynı gendeki birden fazla lokusu hedeflemek için sgRNA'ları çoğaltarak, somatik ve germ hattı mutajenez oranları %86'ya kadar yükseldiEk olarak, birçok nesil boyunca, beyaz mutantların canlı homozigot stokları laboratuvarda başarıyla tutulmuştur.
Sağkalım ve mutajenez oranlarını optimize etmek için, halokarbon yağı, enjeksiyon sıvısı ve iğneler dahil olmak üzere tüm materyaller mikroenjeksiyonlara başlamadan önce uygun şekilde hazırlanmalıdır. Bu, daha akıcı ve odaklanmış bir mikroenjeksiyon işlemine izin verecektir.
Genel Bakış
Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi için optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyolarına yönelik mikroenjeksiyon tekniklerini ana hatlarıyla açıklamaktadır. Bu yöntem, genetik araştırmalar ve vektör kontrol teknolojileri için kalıtsal germ hattı mutasyonlarının verimli bir şekilde oluşturulmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik mühendisliği
- Vektör biyolojisi
- CRISPR/Cas9 teknolojisi
Arka Plan
- Culex quinquefasciatus, yeterince çalışılmamış bir hastalık vektörüdür.
- Mikroenjeksiyon teknikleri, genetik kontrol araçlarının geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Diğer böcek türleri için mevcut protokoller iyi bir şekilde yapılandırılmıştır.
- Bu yöntem, Culex türlerinin kendine özgü biyolojik özelliklerine uyum sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Culex quinquefasciatus için bir mikroenjeksiyon protokolü geliştirmek.
- Gen fonksiyonu çalışmalarını ve genetik kontrol teknolojilerini kolaylaştırmak.
- Enjekte edilen embriyolarda sağkalım ve mutajenez oranlarını optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yumurta toplama ve salyaktan ayırma teknikleri.
- Halokarbon yağ ve enjeksiyon karışımının hazırlanması.
- Mikromanipülatör kullanılarak embriyolara mikroenjeksiyon yapılması.
- Enjeksiyon sonrası mutant fenotiplerin taranması.
Ana Sonuçlar
- %64-82 oranında embriyo sağkalım oranı elde edildi.
- Somatik mutajenez oranları %37-57 arasında değişti.
- Germ hattı mutajenez oranları %61'i aştı.
- Multiplex sgRNA kullanımı mutajenez oranlarını %86'ya çıkardı.
Sonuçlar
- Protokol, somatik ve germ hattı mutasyonlarını başarıyla oluşturur.
- Mutantların canlı homozigot stokları laboratuvarda korunmuştur.
- Materyallerin uygun şekilde hazırlanması mikroenjeksiyon sürecini iyileştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel İlgililik
Verimli embriyo mikroenjeksiyonu, Batı Nil virüsü ve lenfatik filariasis gibi hastalıkların temel vektörü olan Culex quinquefasciatus'ta bölgeye özgü mutajeneze olanak tanır. Bu yetenek, fonksiyonel gen çalışmaları için kalıtsal mutasyonlar oluşturarak, erken keşif aşamasındaki hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Protokol, türe özgü engelleri gidererek vektör kontrol hedef belirleme ve preklinik model geliştirmedeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilişkili bir böcek vektöründe hassas gen nakavtı aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Patojen iletiminde yer alan hedeflerin fonksiyonel doğrulaması için germ hattı mutasyonları oluşturmaya yönelik tekrarlanabilir bir yöntem sunar.
- Öngörücü Değer: Gen bozunumunu, vektör yetkinliği için kritik olan fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı kılavuz RNA tasarımları boyunca düzenleme verimliliğini değerlendirmek için ölçülebilir mutajenez çıktıları (somatik ve germ hattı oranları) üretir.
- Operasyonel Değer: Embriyo elleme ve enjeksiyon koşullarını standartlaştırarak deneysel partiler arasında analiz tekrarlanabilirliğini artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Mutajenez oranlarını artırmak için çoklu sgRNA iletimine olanak tanıyarak yüksek kapasiteli hedef taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Uzun süreli fenotipik ve aktarım çalışmaları için stabil genetik hatlar oluşturmak amacıyla kalıtılabilir beyaz gözlü mutantlar üretir.
- Operasyonel Değer: %64–82 oranında embriyo sağkalım oranları sağlayarak, sonraki fenotipik taramalar için yeterli sayıda canlı mutant elde edilmesini sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Nesiller boyunca canlı homozigot mutant stoklarını koruyarak, genetik kontrol stratejilerinin preklinik değerlendirmelerini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, yeterince incelenmemiş bir vektör türünde fonksiyonel genomikleri mümkün kılarak, hedef hipotezinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Patojen-vektör etkileşimlerinde gen fonksiyonunu aydınlatmak için CRISPR/Cas9 aracılı mutajenez yoluyla hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Rehber RNA etkinliğini karşılaştırmak ve düzenleme koşullarını optimize etmek için kantitatif mutajenez oranları (%37–57 somatik, >%61 germ hattı) sağlar.
- Analizler: Stereoskopik tarama yoluyla mutant fenotiplerin skorlanmasına olanak tanıyarak hit doğrulaması için ölçülebilir çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Stabil mutant hatlar oluşturarak gen keşfinden preklinik model geliştirmeye kadar olan sürekliliği kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Culex türleri genelinde uyarlanabilir, standartlaştırılmış bir mikroenjeksiyon iş akışı oluşturarak tekrarlayan protokol geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Vektörle bulaşan bir hastalık modelinde doğrudan genotip-fenotip bağlantısını mümkün kılarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış yumurta hizalama, halokarbon kaplama ve iğne hazırlama adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Vektör sağkalımı veya patojen iletimi için temel olan hedeflerin fonksiyonel doğrulamasını sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kalıtsal mutasyon oranlarına ve fenotipik şiddete dayalı olarak hedeflerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Embriyo işlemleri, mikromanipülasyon ve floresan veya stereoskopik tarama konularında uzmanlık gerektirir.
- Embriyo canlılığı için iğne çekici (needle puller), mikroenjektör ve halokarbon yağı hazırlığına bağlıdır.
- Yumurta toplama ve sal ayrıştırma tekniklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı Culex türlerine adaptasyon, enjeksiyon hacminde ve iğne geometrisinde ayarlamalar gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında embriyo hassasiyeti ve hayatta kalma oranlarını korumak için enjeksiyon sonrası hemen iyileşme sürecine ihtiyaç duyulması yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
