Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

ATP önemli bir hücresel haberci olduğundan, ATP'nin reseptörlerine bağlanmasını yüksek hassasiyetle ölçmemizi sağlayan bir yöntem geliştirdik. Nükleotid türevleri ve floresan olarak etiketlenmiş proteinler arasındaki FRET'i kullanarak, nükleotidin bozulmamış fonksiyonel reseptörlere bağlanmasını gerçek zamanlı olarak ve mükemmel uzamsal çözünürlükle izleyebiliriz. Bu yöntemi, hücresel metabolizmanın, belirli diyabet formlarında rol oynayan ATP'ye duyarlı potasyum kanalı üzerindeki etkilerini anlamak için kullanıyoruz.

Çatısız bir membran deneyi yapmak için, önce transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasından küçük bir parçayı kırmak için bir çift forseps kullanın ve parçayı PBS ile durulayın. Kapak kayması polilizin ile önceden kaplanmışsa, parçayı iki mililitre PBS içeren 35 milimetrelik bir çanağın altına yerleştirin ve numunenin üç ila beş milimetre üzerinde üç milimetrelik bir prob sonikatörünü tutun, hücrelerin çatısını açmak için 200 ila 500 milisaniye boyunca 50 watt ve% 20 ila% 40 genlikte titreştirin. Kapak kaymaları önceden kaplanmamışsa, PBS ile duruladıktan sonra, gösterildiği gibi kısa sonikasyonla hücreleri açmadan önce parçayı% 0.1 poli-L-lizin içeren bir tüpe yaklaşık 30 saniye batırın.

Sonikasyonlu parçayı iki mililitre banyo çözeltisi içeren kapalı bir cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı yüksek sayısal diyaframlı 60x suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin. Mikroskobun kamera portunun yüksek hassasiyetli bir CCD kamera ile seri olarak bir spektrografa bağlı olup olmadığını kontrol edin ve banyo odasını dakikada 0,5 ila bir mililitre tampon akış hızında tamponla perfüze etmek için peristaltik bir pompa kullanın. ANAP etiketli kanalı ifade eden çatısız membran parçalarını tanımlamak için, floresan kanallı membranları bulmak üzere numuneyi görüntüleyin.

Spektrometre maskesini mikroskoptaki kamera portu ile spektrograf arasına kısmen takın. Maskenin gölgesi kamera görüntüsünde görünecektir. Analiz için ilgili bölgenin seçilmesine izin vermek için çatısız membranın parlak bir alan ve floresan görüntüsünü elde edin.

Mikrohacim perfüzyon sisteminin ucunu çatısız membrana yaklaştırın. ANAP floresansının bir görüntüsünü elde etmek için, 390/18 nanometre bant geçiş uyarma filtresi ve 416 nanometre kenar dikroik aracılığıyla 385 nanometre LED ile membranı heyecanlandırın ve yayılan ışığı 400 nanometre longpass emisyon filtresinden toplayın. Spektrometre maskesini takın ve yayılan ışığın içinden geçtiğinden emin olun.

İlgilendiğiniz bölgeyi spektrometre maskesinin yarığıyla hizalayın. Spektrometre ızgaralarını devreye sokun. Izgaralar yerleştirildiğinde, spektrometre tarafından kırılan ışık, spektral görüntüler üretmek için CCD kameranın çipine yansıtılacaktır.

Görüntüler uzamsal bilgileri Y boyutunda koruyacaktır. X boyutu dalga boyu ile değiştirilecektir. Nükleotid içermeyen tampon çözeltisi ile perfüzyon yaparken, deneyin geri kalanında toplanan verilerin aşağı akış düzeltmesi ve normalleştirilmesi için bir veya daha fazla 0,1 ila on saniyelik pozlama elde edin.

Daha sonra, bir konsantrasyon tepki eğrisi oluşturmak için banyo çözeltisine bir dizi TNP ATP konsantrasyonu uygulayın, kararlı bir duruma ulaşılmasını sağlamak ve her konsantrasyon için bir maruz kalma elde etmek için her çözeltiyi en az bir dakika perfüze edin. Her konsantrasyondan sonra, TNP ATP'yi işlem sonrası maruz kalma görüntüsü elde etmeden önce en az bir dakika boyunca nükleotid içermeyen banyo çözeltisi ile yıkayın. Yama kelepçeli florometri deneyi gerçekleştirmek için, önce yama pipetlerini kalın duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 1,5 ila 2,5 megaohm dirence çekin.

Daha sonra, transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasını, iki mililitre banyo çözeltisi içeren cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı ters çevrilmiş mikroskopa monte edin. Banyo odasını banyo çözeltisi ile perfüze edin ve ANAP etiketli kanalları ifade eden bir hücre tanımlayın. Yama pipetine hafif pozitif basınç uygulayın ve pipeti bir banyo odasına yerleştirin.

Pipetinizi hücrenin zarına bastırın ve gigaohm sızdırmazlık elde etmek için nazik bir emme uygulayın. Yamayı tüketmek için, pipet tutucuyu yamalı hücreden hızla uzaklaştırın. Yama pipetinin ucunu perfüzyon sisteminin ucuna yaklaştırın ve yamanın spektrometre maskesinin yarığı içinde olup olmadığını kontrol edin.

Ardından TNP ATP'yi uygulayın ve görüntü spektrumlarını toplayın. Bu görüntülerde, turuncu floresan proteini ile etiketlenmiş ATP'ye duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir HEK293T hücresinden tipik bir çatısız membran parçası gözlemlenebilir. Beş mikromolar TNP ATP'ye maruz kalan bir HEK293T hücresinden çatısız bir zarda ANAP etiketli ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının bu spektral görüntüsünde, ANAP ve TNP ATP'nin tepe emisyonuna karşılık gelen iki yüksek yoğunluklu bölge gözlemlenebilir.

Son bir spektrum, ortalama arka plan spektrumunun ortalama ilgi alanı spektrumundan çıkarılmasıyla elde edilebilir. Burada, çoklu maruziyetlerden sonra pik ANAP floresansında azalma gözlenebilir. TNP ATP'nin yokluğunda çeşitli maruziyetlerden kaynaklanan pik floresan, tek bir üstel bozunmaya takıldı.

Bu veriler daha sonra fotobeyazlatma eserlerini düzeltmek için kullanıldı. Burada, TNP ATP'nin yokluğunda ve varlığında ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir hücreden elde edilen çatısız bir membrandan elde edilen temsili spektral görüntüler gösterilmiştir. Düzeltilmiş emisyon spektrumlarının gözlemlenmesi, donör ve alıcı floresan emisyonu arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu şekilde, tipik bir yama-kelepçe florometri deneyinden ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarından gelen temsili akımlar ve spektrumlar gösterilmiştir. Emisyon spektrumları, çatısız membranlar için gösterildiği gibi arka plan ve ağartma için düzeltilir. Floresan sinyalinin reseptörünüze özgü olduğunu doğrulamak için kontrollere dikkat edin.

Profüzyonunuzun hızlı, verimli ve eksiksiz olduğundan emin olun ve pozlamalarınızı mümkün olduğunca kısa tutun. Bu yöntem, reseptör doluluğu ve bunun işlevle nasıl ilişkili olduğu hakkındaki soruları yanıtlar. Benzer bir kurulumla kullanılan diğer FRET teknikleri, reseptördeki ligand kaynaklı doğrulama değişikliklerini araştırabilir.