Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma
12 Ocak 2021
Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.
Sistem, araştırmacıların optogenetik deneyler için ucuz ve çok yönlü bir aydınlatma sistemini kolayca inşa etmelerini sağlar. Bu tekniğin avantajları, LED aydınlatma zamanlamasını, görünür yakın IR spektrumunu kapsayan mevcut dalga boylarıyla programlama yeteneğini ve LED'lerin çeşitli bağlamlarda kullanılabileceğini içerir Bir elektrik devresi oluşturmak için, baskılı devre kartını yardım ellerine klipsleyin ve jumper tellerini yerleştirin, bunları A1 ve A3 iğne deliklerini oluşturacak şekilde birbirine bağlayın. D2 jumper teli D6 iğne deliğine ve güç kaynağı artı yedi numaralı jumper kablosu A7 iğne deliğine girer. Terminalleri 45 derece bükün ve akı ekleyin.
Lehimlemeden sonra, tellerin arkalarını kesin. Lehimli dişi telin bir ucunu konektörü A5 deliğine bağlayın. Ardından direncin bir ucunu A5 deliğine bağlayın.
Konektörün diğer ucunu toprağa bağlayın. Ardından direncin diğer ucunu toprağa bağlayın ve bağlantıyı lehimleyin. Arduino konektörü için, telin uçlarını kablo konektörlerine sıkın ve kıvrımlı uçları dikdörtgen konektörden geçirin.
LED'leri ayarlamak için, üstten lehim eklerken aşağıdan ısıtarak bir tel teneke kutulayın. Büyük lehimleme ucunun üzerine bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanı akı içeren temasta ısıtmak için ucu kullanın. Birkaç saniye sonra, lehimi her temas boyunca ayrı ayrı sürükleyin ve siyah teli bir saç tokası kullanarak katoda sabitleyin.
Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin ve LED tabanındaki lehim eriyene kadar ucu telin üzerine bastırın. Teli basılı tutun ve teli yerinde tutarken havyayı çıkarın. LED bağlantıları için pedlerin üzerine az miktarda lehim macunu yerleştirin ve LED'i pedlerin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın.
Önceden konserve edilmiş kırmızı teli anot üzerinde tutun ve teli kesmek için bir saç tokası kullanın. Gösterildiği gibi büyük uca lehim ekleyin ve LED tabanındaki lehim eriyene ve lehim macunu eriyip gümüş olana kadar ucu bağlantıya bastırın. LED telleri yapmak için, uzunluğa kadar kesilmiş telin üzerine 4,76 milimetrelik bir büzülme tüpü ve tel konektörü için tel üzerine 3,18 milimetrelik bir büzülme tüpü yerleştirin.
Şeritleyin ve tel uçlarına akı ekleyin. Teli kabloya bağlamak için yardım ellerini kullanın ve konektör ucunu bir tel ucuyla döndürün. Malzemeleri birlikte lehimleyin ve diğer teli kuruluma aynı şekilde takın ve lehimleyin.
Ardından LED kablolarını, LED tabanının altındaki bantla yardım ellerine klipsleyin. Daha sonra, epoksiyi üreticinin talimatlarına göre karıştırın ve epoksiyi lehimli LED'in üstüne yayın. Kürek matkap ucunu kullanarak, LED'in yerleştirileceği kutunun üstünden 1,5 santimetrelik bir delik açın ve LED teline yer açmak için deliğin bir tarafında bir çentik yapmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın.
LED'in aydınlatacağı deliği kaplayan kara kutuya 25 ila 30 milimetrelik bir gizlilik filmi parçası bantlayın ve LED'i deliğin üstündeki kara kutunun dışına bantlayın. Dört LED kontrol sistemi için, kutunun kapağına 3,81 santimetre arayla dört adet 0,83 santimetre delik açın ve sol üst köşeye 1,19 x 1,90 santimetrelik dikdörtgen bir delik açmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın. Bir kürek matkap ucu kullanarak, kutunun arkasına 1,5 santimetrelik bir delik açın ve deliğe bir rommet yerleştirin.
Bilgisayar kontrollü LED'ler için, mikrodenetleyicinin yapıştırılacağı alanı zımpara kağıdı kutuya ve mikrodenetleyici tutucusunun alt tarafına yerleştirin. Mikrodenetleyiciyi tutucunun üzerine oturtun, ardından tutucuyu kara kutuya sabitlemeden önce tutucuyu ve kutuyu epoksi yapın. Ardından klipsin üzerine çift taraflı bant yerleştirin ve klibi kutunun içine sabitleyin.
Fitokrom B'yi eksprese etmek için transfekte edilen ancak fikosiyanin bilin olmayan örneklerde, muhabir DNA miktarı arttıkça sızıntı artar. Ek olarak, fikosiyanin iki krom üreten plazmid de dahil olmak üzere tüm fitokrom B gen anahtarı uzak kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da transfeksiyon karışımı içindeki muhabir yapısının artan miktarları ile artar. Benzer şekilde, ışığa duyarlı hücreler kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da artan muhabir miktarı ile artar.
Kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerin indüksiyon seviyelerini uzak kırmızı ışıkla tedavi edilen hücrelerle karşılaştırırken, artan miktarda muhabirle birlikte kıvrım aktivasyonunda küçük bir azalma bulunur. Elektrik devresini oluştururken her adımı dikkatlice takip etmek ve her bir bileşeni lehimlemeden önce iğne deliği numaralarını satır satır iki kez kontrol etmek önemlidir. Bu protokol, çeşitli dalga boyları kullanarak birçok numune türünün veya optogenetik araçların optik stimülasyonu için kullanılabilir ve aydınlatma programlarının programlanmasına izin verir.
Genel Bakış
Bu protokol, gen ifadesinin kırmızı ve uzak-kırmızı ışıkla kontrol edilmesini sağlayan, optogenetik deneyler için çok yönlü bir aydınlatma sisteminin kurulumunu açıklamaktadır. Sistemin inşası ve LED aydınlatmanın programlanması için adım adım talimatlar sunulmuştur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optogenetik
- Gen ekspresyon kontrolü
- Aydınlatma sistemleri
Arka Plan
- Optogenetik, ışık kullanarak hücresel fonksiyonların hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar.
- PhyB ve PIF3, ışığa duyarlı gen düzenlemesindeki temel bileşenlerdir.
- LED'ler, çeşitli aydınlatma programları için programlanabilir.
- Bu sistem, maliyet etkin olacak ve farklı deneysel düzeneklere uyarlanabilecek şekilde tasarlanmıştır.
Çalışmanın Amacı
- Optogenetik bir aydınlatma sistemi kurmak için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Araştırmacıların, ışığın belirli dalga boylarını kullanarak gen ekspresyonunu kontrol etmelerini sağlamak.
- Optogenetik araçların çeşitli deneysel bağlamlarda kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- LED kontrolü için bir elektrik devresinin kurulması.
- LED aydınlatma zamanlamasının ve dalga boylarının programlanması.
- Otomatik kontrol için bir mikrodenetleyicinin montajı.
- Sistemin çeşitli raporlayıcı konstrüktlar ile test edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Esnek bir aydınlatma sisteminin başarıyla kurulması.
- Daha yüksek raporlayıcı DNA miktarlarıyla artan lusiferaz ekspresyonu gözlemlenmiştir.
- Kırmızı ve uzak-kırmızı ışık kullanılarak gen ekspresyonu üzerinde kontrol sağlandığı kanıtlanmıştır.
- Sistem, farklı örnek tipleri genelinde optik stimülasyona olanak tanır.
Sonuçlar
- Protokol, optogenetik deneyler için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Araştırmacılar, bu sistemi gen düzenlemesindeki çeşitli uygulamalar için kullanabilirler.
- Protokole dikkatle bağlı kalınması, başarılı sonuçlar alınmasını sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Hücresel yolakların optogenetik kontrolü, hedef doğrulaması ve fenotipik taramada hassas mekanistik sorgulamaya olanak tanır. Düşük maliyetli, programlanabilir bir aydınlatma sistemi, gen ekspresyon çalışmaları için tekrarlanabilir ışık iletimini destekleyerek preklinik modellerdeki teknik değişkenliği azaltır. Bu yaklaşım, farklı deneysel bağlamlarda standartlaştırılmış optik stimülasyona izin vererek öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yolak işlevini ve hedef mekanizmasını aydınlatmak için ışığa duyarlı gen anahtarlarının hipotez testlerini gerçekleştirmeye olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hücresel analizlerde sinyal yolaklarının kontrollü pertürbasyonu için ayarlanabilir LED yoğunluğu ve zamanlaması sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik veya genetik perturbasyonlar genelinde optogenetik yanıtların nicelleştirilmesi için standardize edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını destekler.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir okumalar için programlanabilir aydınlatma çizelgeleri ve dalga boyu seçimi aracılığıyla assay standardizasyonunu kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Ayarlanabilir ışık parametreleri ile hastalıkla ilişkili sistemlerin optik stimülasyonuna olanak tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği kanıtlar.
- Operasyonel Değer: Reporter bazlı analizlerde kırmızı ve uzak kırmızı ışığa verilen doza bağımlı yanıtları nicelendirerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına imkan tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Aydınlatma sistemi, gen ekspresyonunun kontrollü optik pertürbasyonuna olanak tanıyarak keşif biyolojisi iş akışlarına entegre olur ve ölçülebilir fenotipik çıktılar aracılığıyla öncü bileşiklerin belirlenmesini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Hedef fonksiyonunu sorgulamak için optogenetik araçların hassas zamansal ve mekansal kontrolüne olanak tanıyarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Belirlenen aydınlatma koşulları altında lusiferaz ekspresyonu gibi kantitatif bağımlı değişken ölçümlerini mümkün kılar.
- Analitik: Hedef doğrulama ve hit onayı için istatistiksel analizi bilgilendiren, tekrarlanabilir ışık-doz yanıt verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık modellerinde optogenetik konstrüktların test edilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform sağlayarak preklinik sürekliliğe bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Hücresel süreçlerin optik kontrolünü gerektiren birden fazla proje için ölçeklenebilir ve uyarlanabilir bir kapasite olarak tasarlanmıştır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Işık kontrollü deneylerde mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulamada öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve deneysel düzenekler arasında aydınlatma protokollerinin standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Hedef doğrulamadaki yanlış pozitifleri azaltan, güvenilir ve nicelendirilebilir optogenetik okumalar aracılığıyla iyileştirilmiş devam/tamam kararları.
- Portföy Etkisi: Tekrarlanabilir optik stimülasyon sonuçlarına dayalı olarak hedeflerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Devre montajı ve LED bağlantılarının lehimlenmesi için temel elektronik yetkinliği.
- Sistem kurulumu için Arduino uyumlu mikrodenetleyicilere ve lehimleme ekipmanlarına erişim.
- Tekrarlanabilir deneysel koşullar sağlamak amacıyla ekipler arasında aydınlatma protokollerinin standartlaştırılması.
- Belirli dalga boyları veya yoğunluk aralıkları gerektiren farklı optogenetik araçlar için adaptasyon değerlendirmeleri.
- Pratik sınırlama: Belirli örnek türleri için LED konumlandırmasını ve ışık penetrasyonunu optimize etmek amacıyla manuel kalibrasyon gerekebilir.
