Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma
15 Şubat 2021
Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.
Bu yöntem, zebra balığı kalbindeki hedef proteinlerin ekspresyonunun doğru ve kolay bir şekilde tespit edilmesi için kullanılabilir. Hedef proteindeki değişim immünofluoresans ölçümü ile doğrudan tespit edilir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi zebra balığı embriyo toplama ve tedavi gerçekleştirin.
Döllenmeden 72 saat sonra embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin. Malformasyon oranlarını hesaplayın ve tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin ve ardından Türkiye'nin çoklu karşılaştırma testi.
Embriyoları mililitre MS222 başına 0,6 miligram ile uyuşturuyorktan sonra, 30 saniye boyunca kalp atışlarını kaydedin ve Image J yazılımını kullanarak kalp atışlarını ölçün. Stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesi ile zebra balığı embriyolarından kalpleri dikkatlice inceleyin. Temiz bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 pbs mikrolitresine% 4 paraformaldehitin 50 mikrolitresini ekleyin, ardından üç parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az beş dakika kurutun. Slaytları PBST'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
%5 BSA çözeltisi elde etmek için 1.000 mikrolitre PBST'ye 50 mikrolitre BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 8-hidroksideoksiguanosin'e karşı iki mikrolitre fare monoklonal antikorunu ve 296 pbst mikrolitresinde gama-H2AX'a karşı iki mikrolitre tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.
Kalp örneklerini, oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil antikor kokteyl çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 500 pbst mikrolitresinde fitc etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunun bir mikrolitresini ve bir mikrolitre psy-3 keçi anti-tavşan ikincil antikorun seyreltin.
Örnekleri sekonder antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Nükleer boyama için numunelere 20 mikrolitre DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Slayda bir kapak kayması uygulayın ve kurumasını ve hareketi önlemek için oje ile kapatın. Örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO denetim örneklerinin ortalamasını kullanarak göreli değişiklikleri hesaplayın ve verilerin istatistiksel önemini belirleyin.
Antioksidan, N-asetil-L-sistein veya NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM 2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi. PM 2.5'ten EOM, DMSO kontrolü ile tedavi edilen kalplere kıyasla perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kardiyak teratogenezde önemli bir artışa mal oldu. EOM'ye maruz kalan embriyolarda da kalp atış hızı önemli ölçüde azaldı.
NAC zayıflatılmış EOM kaynaklı kalp kusurlarının eklenmesi. EOM ile tedavi edilen dokularda DNA hasarının boyutunu değerlendirmek için immünoresans testi kullanıldı. EOM ile tedavi edilen zebra balığı embriyolarının kalplerinde 8-hidroksideoksiguanosin ve gama-H2AX ekspresyozin düzeyleri önemli ölçüde artmış, bu da sırasıyla oksidatif DNA hasarında ve DNA çift iplikçik kırılmalarında artış olduğunu gösterir.
EOM kaynaklı DNA hasarı NAC takviyesi ile kısmen etkisiz hale bırakıldı. Bu protokolü denerken, örnekleri PBS ile yıkarken dikkatli olun, çünkü zebra balığı kalbi slayttan soyulabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, zebra balığı embriyolarının diseke edilmiş kalplerinde PM 2.5 kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofloresan analiz kullanır. Yöntem, zebra balığı kalbindeki hedef protein ekspresyonunun doğru bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Toksikoloji
Arka Plan
- İmmünofloresan, protein ekspresyonunu görselleştirmek için güçlü bir tekniktir.
- Zebrafish embriyoları, gelişimsel süreçleri incelemek için değerli bir modeldir.
- PM 2.5 maruziyetinin, DNA hasarı dahil olmak üzere çeşitli sağlık sorunlarına yol açtığı bilinmektedir.
- Çevresel toksinlerin gelişim üzerindeki etkilerini anlamak, halk sağlığı açısından kritik önem taşır.
Çalışmanın Amacı
- PM 2,5'in zebra balığı kalplerindeki DNA bütünlüğü üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Protein ekspresyonundaki değişiklikleri saptamak için immünofloresansı kullanmak.
- Zebra balığı embriyolarındaki kalp malformasyonlarını değerlendirmek için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Zebrafish embriyolarının toplanması ve işlenmesi.
- Hedef proteinleri saptamak için immünofloresan analiz.
- Döllenmeden 72 saat sonra embriyoların stereo mikroskop altında gözlemlenmesi.
- Tek yönlü ANOVA ve Tukey çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapılan istatistiksel analiz.
Ana Sonuçlar
- PM 2.5 maruziyeti nedeniyle zebrafish kalplerindeki DNA hasarının saptanması.
- Perikardiyal ödem ve değişmiş döngüleme (looping) gibi kalp malformasyonlarının tanımlanması.
- Farklı tedavi grupları arasındaki malformasyon oranlarının nicelendirilmesi.
- Bulguların istatistiksel anlamlılığının analiz yoluyla doğrulanması.
Sonuçlar
- PM 2.5 maruziyeti, zebra balığı kalplerinde önemli DNA hasarına yol açar.
- İmmünofloresan analiz, protein ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için etkilidir.
- Bu model, çevresel toksinler ve gelişimsel biyoloji üzerine yapılacak ileri araştırmalar için kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Bu immünofloresan protokolü, gelişimsel kardiyotoksisite için öngörücü bir model olan zebrafish embriyo kalplerindeki DNA hasarı biyobelirteçlerini nicelendirerek, çevresel toksik maddelerin mekanistik risk analizini yapılmasına olanak tanır. Analiz, PM2.5 maruziyetini oksidatif stres ve DNA çift zincir kırılması yolaklarıyla ilişkilendirerek hedef doğrulama ve fenotipik tarama iş akışlarını destekler. Erken keşif aşamasındaki risk değerlendirmesi için translasyonel biyobelirteç verileri sağlayarak kimyasal kütüphanelerin portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Oksidatif DNA hasarı ve çift zincir kırılmalarının mekanistik okumaları olarak 8-OHdG ve γH2AX'i tespit ederek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Kardiyak dokudaki yolak aktivasyonunu açıklığa kavuşturan kantitatif immünofloresan okumalar yoluyla biyolojik risk azaltmayı sağlar.
- Öngörücü Değer: PM2.5-indüklü biyobelirteç değişikliklerini kalp malformasyonu fenotipleriyle ilişkilendirerek hedef güvenini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: İmmünofloresan tabanlı protein ekspresyon saptaması kullanarak genotoksik bileşiklerin alt taramaları için valide edilmiş zebrafish kalp dokusunu hazırlar.
- Operasyonel Değer: Diseke edilmiş kalplerdeki floresan sinyallerin ImageJ analizi aracılığıyla standartlaştırılmış, tekrarlanabilir kantitatif çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Hastalıkla ilgili bir sistemde, çevresel kimyasalların tetiklediği protein ekspresyon değişikliklerini değerlendirmek için platformun yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Korunmuş kardiyak gelişim yollarına sahip bir model olan zebra balığı embriyo kalplerinde DNA hasarını saptayarak hastalıkla olan ilgisini kanıtlar.
- Operasyonel Değer: PM2.5 kaynaklı kardiyotoksisiteye dair mekanistik içgörü sağlayarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliği sağlar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Antioksidan eş tedavisi (örneğin NAC) yoluyla DNA hasarı azalmasını nicelendirerek go/no-go (devam/durdur) kararlarını bilgilendirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, erken aşama tarama kampanyalarında öngörüsel güveni destekleyen mekanistik okumalar sunar.
- Keşif Biyolojisi: Çevresel toksikant maruziyetine yanıt olarak DNA hasarı biyobelirteçlerini nicelleştirerek hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Zebrafish kalplerinde standardize edilmiş immünofloresan boyama ve ImageJ tabanlı floresan nicelleştirme aracılığıyla analiz hazırlığı ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırma ve hit doğrulamasına olanak tanıyan istatistiksel çıktılar (örneğin, göreceli floresan değişimleri, ANOVA kaynaklı anlamlılık) üretir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan kardiyotoksisite değerlendirmesiyle ilgili gelişimsel yolaklara sahip bir zebrafish modeli kullanarak preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bir omurgalı kalp modelinde çeşitli kimyasal kütüphanelerin genotoksik potansiyelini taramak için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gelişimsel toksisite taramasında DNA hasarı yollarının mekanistik olarak riskten arındırılması yoluyla öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Hidrofobik bariyerler ve floresan mikroskobisi kullanılarak uygulanan sabit diseksiyon, boyama ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Biyobelirteç değişikliklerini fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek toksikoloji programlarındaki geç aşama biyolojik riskini azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gelişen bir kalp modelinde DNA hasarı potansiyeline dayalı olarak bileşiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Zebrafish embriyosu yönetimi, kalp diseksiyonu ve immünofloresan tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Sinyal kantifikasyonu ve istatistiksel analiz için floresan mikroskobuna ve ImageJ yazılımına bağımlıdır.
- Doku kaybını önlemek için diseksiyon zamanlaması, antikor inkübasyonu ve yıkama prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Analizin diğer zebrafish dokularına veya hastalık modellerine genişletilmesi durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Kaynak materyalde belirtildiği üzere, yıkama sırasında kalp dokusunun kopması gibi, PBS kullanımında dikkatli olmayı gerektiren pratik sınırlamaları kapsar.
