Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme
16 Mayıs 2021
Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.
Bu yeni doku temizleme protokolü, kalpteki belirli hücre tiplerine ve yaralanma koşullarındaki davranışlarına daha doğru bir in vivo bakış sağlamak için mevcut teknolojiyi geliştirir. Bu protokol hızlı ve oldukça basittir. Hücre veya doku lekesi gerektirmeden arka plan dokusu oto floresanından minimum parazitle marca floresanının korunmasına izin verir.
Deneysel farenin ventral yüzeyini temizlemek için% 70 etanol ıslatılmış gazlı bez ped kullanarak başlayın. Xiphoid işleminin yaklaşık üç metre altında üç santimetre enine kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve cildi alttaki karın duvarı dokusundan ayırmak için fareyi karından xiphoid işlemine deglove edin. Deri altı karın duvarı dokusunda, xiphoid işleminin üç santimetre altında iki santimetrelik enine bir kesi yapın ve bu kesiden göğüs kafesinden orta çizgiden dikey bir kesik yapın.
Kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini geriye sabitle. Ve üstün vena kava ve aort içine soğuk PBS enjekte etmek için 27 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Tüm kan kalpten temizlendiğinde, sabitleme işlemine başlamak için üstün vena kava ve aort içine 10 mililitre soğuk% 4 PFA teslim edin.
Tüm fiksatif yanıp söndüğünde, kalbi kesin ve atria, sağ ventrikül ve septum ve sol ventrikülü ayırmak için düz bir bıçak neşteri kullanın. Bir fındık makinesinde dört santigrat derecede bir gecede inkübasyon için kalbi 15 mililitrelik konik bir soğuk % 4 PFA tüpüne yerleştirin. Ertesi sabah, yeni hazırlanmış bir hidrojel çözeltisine% 0.25 fotoğraf başlatıcı çözelti ekleyin ve kalbi hidro jele aktarın.
Konik tüpü, fiziksel rahatsızlık olmadan dört santigrat derecede bir gece inkübasyonu için folyoya sarın. Ertesi sabah, kalbi 15 mililitrelik bir PBS tüpüne dikkatlice aktarmak için forseps kullanmadan önce tüpü 2,5 saat boyunca 37 santigrat derece boncuk banyosunda ısıtın. Kalbi PBS'de bir saat boyunca bir besleyicide 37 santigrat derecede yıkayın ve kalbi aktif bir elektroforezi makinesinin sepetine aktarın.
Kapağı yerine sabitleyin ve aktif elektroforez odası haznesini elektroforez temizleme çözeltisi ile doldurun. Oda dolduğunda, sepeti çözeltiye batırın ve elektroforezi makinesinin kapağını yerine sıkın. Daha sonra elektroforezi makinesini 1,5 saat boyunca 1,5 amper ve 37 santigrat derecede çalıştırın.
Elektroforeziden sonra, opak doku kalmadığından emin olmak için kalbin görsel olarak kontrol edin. Temizlenmiş kalbi 15 mililitrelik ikide üç kez bir saat boyunca taze PBS'de bir besleyicide yıkama başına 37 santigrat derecede yıkayın. Heme oto floresanını azaltmak için kalbi renksizleştirme ajanına batırmadan önce.
48 saat sonra, kalbi pbs'de gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve görüntülemeden önce 48 saat boyunca yeni hazırlanmış RIMS'de kalbi aşındırın. Temizlenmiş kalbin 3D görüntülenmesi için, önce, 3D baskılı bir alt haznenin altına, numunenin görüntülendiği yükseklikte ince bir vakum yağı tabakası yerleştirin. Rezervuarı RIMS ile doldurun ve kabarcıkları çıkarmak için bir pipet ucu kullanın.
Sol ventrikül duvarı yukarı bakacak şekilde kalbi RIMS'e dikkatlice yerleştirin, çözeltiye kabarcık sokulmamalarına dikkat edin. 3D baskılı üst rezervuar parçasının alt yüzeyine bir cam kapak kayması takmak için vakum gresi kullanın ve üst rezervuar kapaklarını kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek alt rezervuarlara yerleştirin. Daha sonra üst rezervuarları gliserol ile doldurun.
Temizlenmiş kalpleri görüntülemek için bir konfokal mikroskop kullanın. Rafine kardiyak doku temizlemeyi 3D görüntüleme ile birleştirmek, kardiyak fibroblastların gelişmiş ayrıntılı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntüleme tekniği kullanılarak fibroblastların yoğun bir şekilde paketlendiği ve yaralanmamış kalplerde iğdelenmiş morfolojiye sahip olduğu gözlenir.
İskemi reperfüzyonu yaralanmasından sonra, yaralanmadan sonraki ilk üç gün iskemik bölgede kardiyak fibroblast kaybı görülür. 7. ve 14. 28. güne gelindiğinde, kalbin yaralı bölgelerini çevreleyen kardiyak fibroblast popülasyonu en büyük yoğunluktadır.
Miyokard enfarktüsü yaralanmasından bir buçuk gün sonra, yaralı sol ventrikülde az sayıda fibroblast kalır. Ancak üçüncü güne gelindiğinde, fibroblastlar genişler ve sol ventrikülün çoğunda bulunur. İskemik cerrahinin aksine, anjiyotensin iki ve fenolefrinin birkaç hafta boyunca infüzyonu kalp dokusu kaybına ve duvar incelmesine neden olmaz.
Bunun yerine, fibroblast, rafine edilmiş doku temizleme protokolünü kullanırken görüldüğü gibi sağ el sarmal kasılma deseninin ekseni boyunca hizalanır. Ek olarak, anjiyotensin iki ve fenolefrin tedavisinden sonra, fibroblastlar iskemi reprofüzyonu ve miyokard enfarktüs yaralanması modellerinde gözlenen iğ şeklinin aksine küçük ve yuvarlak görünür. Elektroforetik temizlemenin özellikle yaralanma protokollerinden geçmiş kalplerle çalışırken dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.
Bu protokol, kardiyak fibroblastların in vivo yaralanmaya nasıl tepki verdiklerini değerlendirmek için kullanılabilir. Kalbin yaralanmaya hücresel düzeyde nasıl tepki verdiğini anlamak için farklı floresan belirteçler de kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Yetişkin fare kalbi için, arka plan otofloresansını minimize ederken spesifik hücre tiplerinin görüntülenmesine olanak tanıyan geliştirilmiş bir doku şeffaflaştırma yöntemi geliştirilmiştir. Bu protokol, kardiyak doku çalışmalarında kullanılan mevcut teknikleri geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kardiyovasküler Biyoloji
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Doku berraklaştırma teknikleri, yoğun biyolojik dokuların görüntülenmesi için temel teşkil eder.
- Otofloresans, görüntüleme çalışmalarında spesifik hücresel sinyalleri maskeleyebilir.
- Etiketlenmiş hücrelerin floresansının korunması, doğru analiz için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler boyama gerektirebilir ve bu da süreci karmaşıklaştırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hızlı ve basit bir doku şeffaflaştırma protokolü geliştirmek.
- Kardiyak dokudaki fibroblast floresansının görüntülemesini iyileştirmek.
- Otofloresanstan kaynaklanan arka plan girişimini azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Farenin ventral yüzeyini temizlemek için %70 etanol kullanıldı.
- Kalbe erişmek için cerrahi kesiler yapıldı.
- Yeni şeffaflaştırma protokolü kalp dokusuna uygulandı.
- Boyama yapmadan marka floresansı korundu.
Ana Sonuçlar
- Yeni protokol, yoğun kalp dokusunu etkili bir şekilde temizledi.
- İşlem sırasında fibroblast floresansı korundu.
- Arka plan otofloresansı önemli ölçüde azaltıldı.
- Yöntem, kalp hücrelerinin in vivo görüntülemesinin daha iyi yapılmasını sağlar.
Sonuçlar
- Bu geliştirilmiş yöntem, kalp dokusu çalışmalarını iyileştirir.
- Kalp yaralanması yanıtlarını inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sunar.
- Protokol verimlidir ve ek boyama ihtiyacını minimize eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Kardiyak fibroblast dinamiklerinin üç boyutlu olarak anlaşılması, ventrikül sertliğini ve kalp yetmezliği ilerlemesini tetikleyen fibrozis mekanizmalarına dair kritik bilgiler sağlar. Bu geliştirilmiş CLARITY tabanlı doku şeffaflaştırma yaklaşımı, antikor penetrasyon kısıtlamaları veya floresan kaybı olmaksızın fibroblast davranışının yüksek doğrulukla, tüm organ düzeyinde görselleştirilmesini sağlayarak kardiyovasküler hedef doğrulamada mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yöntem, iskemik ve non-iskemik hasar modellerine karşı uzamsal olarak çözümlenmiş fibroblast yanıtlarını ortaya çıkararak, erken keşif aşamalarındaki karar süreçlerine yön veren öngörüsel bir değer sunar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kardiyak fibrozisteki patojenik ve onarıcı rollerini netleştirmek için, sağlam dokudaki fibroblast lokalizasyonu ve morfolojisinin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Genetik fibroblast işaretlemesini (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP), sağlıklı ve hasarlı kalplerdeki uzamsal fenotiplerle ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörü Güveni: Anjiyotensin II/fenilefrin sonrası hizalı bantlar veya iskemi sonrası sınır bölgelerden yeniden popülasyon gibi hasara özgü fibroblast paternlerini ortaya çıkararak mekanistik hipotezlerdeki riskleri azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Fibroblast yoğunluğunun, dağılımının ve morfolojisinin kantitatif 3D analizi için konfokal görüntülemeye uygun, berraklaştırılmış ve floresan işaretli kalp dokuları üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Standartlaştırılmış elektroforez tabanlı berraklaştırma (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) ve RIMS dengeleme, deneysel gruplar arasında tutarlı doku optik özellikleri sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Aktif elektroforez hücrelerinde çoklu örnek işlemeyle uyumludur; bu sayede kontrol, iskemik ve hipertansif hasar modellerinin yan yana karşılaştırılmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: Klinik fibrozis fenotipleriyle uyumlu şekilde, insan iskemik hasarını (reperfüzyon) ve basınç aşırı yüklemesini (anjiyotensin II/fenilefrin) taklit eden modellerde fibroblast yanıtlarını yakalar.
- Translasyonel Süreklülük: Antifibrotik müdahale testleri için temel zamansal pencereler olan iskemi sonrası 28. gündeki fibroblast ölümünü, sınır bölge yeniden popülasyonunu ve yoğunluk zirvelerini izler.
- Mekanistik Risk Azaltma: İskemideki pro-fibrotik iğ şekilli fibroblastları, hipertansiyondaki küçük ve yuvarlak fenotiplerden ayırt ederek hedefe yönelik yolak modülasyonuna bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, in vitro bulgular ile preklinik modellerdeki fonksiyonel sonuçlar arasında köprü kuran, uzamsal olarak çözünürleştirilmiş fenotipik veriler sunar.
- Keşif Biyolojisi: 3D doku bağlamında fibroblast aktivasyonu, migrasyonu ve proliferasyonunun hipotez testlerini yapmayı sağlayarak, fibrozise yol açan yolak düzeyindeki katkıları netleştirir.
- Tarama: Bileşik tarama kaskadlarında yüksek içerikli analizlere uygun kantitatif görüntüleme çıktıları (fibroblast yoğunluğu, dizilimi, morfolojisi) üretir.
- Analitik: Fibroblast ağlarının morfometrik ve uzamsal istatistiksel analizini destekleyerek genotipler, yaralanmalar ve zaman noktaları arasında karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Fibroblast dinamiklerini ventriküler yeniden şekillenme zaman çizelgeleriyle ilişkilendirerek, biyobelirteçlerle uyumlu preklinik doğrulamayı destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Fibroblastların ötesinde, birden fazla kardiyovasküler hastalık modeli ve hücre tipi için uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir doku şeffaflaştırma ve görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğal doku mimarisini ve floresan sinyal bütünlüğünü koruyarak fibroblast fonksiyonundaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Kesit alma ve boyama ihtiyacını ortadan kaldırarak iş akışı değişkenliğini azaltır ve 3D fenotipleme için işlem kapasitesini artırır.
- Stratejik Değer: Kalp yetersizliği modellerinde fonksiyonel sonuçları öngören hedef odaklı fibroblast yanıtlarını ortaya çıkararak devam/durdur karar güvenini artırır.
- Portföy Etkisi: Mekansal olarak doğrulanmış hedef etkileşimi ve fenotipik modülasyona dayalı olarak antifibrotik hedeflerin riskle ayarlanmış önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare kalp cerrahisi, perfüzyon fiksasyonu ve hidrojel tabanlı doku şeffaflaştırma tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Aktif elektroforez ekipmanına, konfokal mikroskopiye ve RIMS/gliserol montaj çözeltilerine erişime bağlıdır.
- Hasarlı dokuda aşırı şeffaflaşmayı veya otofloresansı önlemek için şeffaflaştırma süresinin ve sıcaklığının standardize edilmesi gerekir.
- Diğer hastalık modellerine adaptasyon, GFP sinyalini söndürmeden hem kaynaklı arka plan gürültüsünü azaltmak için renk giderme süresinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Uzun süreli görüntüleme stabilitesi, kırılma indisi uyumsuzluğunu ve sinyal kaybını önlemek için uygun RIMS dengelenmesine bağlıdır.
