Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Bu metodoloji videosu, DNA hasarına bağlı hücresel süreci incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için düzenli olarak kullanılan immünostaining ve kromatin immünötemiti protokollerinin önemli adımlarını tanıtır. Bu teknik, araştırmacıların hasarlı genomik lokusa bağlı yeni proteinleri ve DNA onarımı sırasında ince ayarlı düzenleme için gerekli çeviri sonrası modifikasyonlarını tanımlamaları için güçlü araçlar sağlar. Bu teknikler farklı hücresel süreçlerin incelenmesi için uygulanabildiğinden, lazer mikroirradiasyonu veya çekirdeğe dayalı DNA'ya zarar veren indükleme sistemleri kullanılırsa potansiyel bir ilgisi vardır.

Son zamanlarda, DNA onarımı anlayışımızı genişletmek için kullanılabilecek bölgeye özgü DNA hasarına neden olacak birkaç güçlü araç geliştirilmiştir. Biyokimyasal ve genetik yaklaşımlar uygulayan bu mutfak eşyaları, DNA hasarı yerinde DNA onarım komplekslerinin işe alınması ve montajı ile ilişkili hücresel olayların ortaya çıkarıcılığında esastır. Ayrıca, bu teknikler hem sabit hem de canlı hücreler kullanılarak bu süreçlerin tek hücre çözünürlüğünde incelenmesini sağlar.

%10 fetal baldır serumu, 2 milimoler glutamin ve %1 antibiyotik-antimycotic çözelti ile desteklenmiş DMEM kültür ortamında monolayerlerde U2OS hücrelerini koruyun. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit ortamında% 80 izdiham elde edilene kadar 37 derecede büyütün ve her iki ila üç günde bir ortamı yenileyin. Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın.

Hücreleri Tripsin-EDTA çözeltisi ile ayır. Hücreler ayırdığında, hücrelere kültür ortamı ekleyerek, bir hücre süspansiyonu vererek trypsine'nin etkinliğini durdurun. Hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın.

Plaka 20,000 hücre mililitre başına kuyu başına 24 kuyu plakasında steril 12 milimetre yuvarlak kapak kaymaları ile her kuyuda. Kapak kaymalarına bağlanmaya izin vermek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit ortamında 37 derecede 24 saat kuluçkaya bırakın. Hücreleri mililitre neokarzinostatin başına 10 nanogram ile tedavi edin veya endonücleuse tabanlı sistemler aracılığıyla çift iplikçik kırılmalarını teşvik etmek için uygun yöntemi kullanın.

DNA onarımının kinetiğini takip etmek için hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit ortamında 37 derecede bir ila sekiz saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri %4 formaldehit PBS çözeltisi ile 25 derecede 20 dakika sabitleyin. Sabitleme solüsyonını çıkarın ve hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

PBS'yi çıkarın ve PBS'de çözünmüş %0,2 Triton X ekleyin. Örnekleri 20 dakika kuluçkaya yatır. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

BSA-PBST'de seyreltilmiş %5 BSA ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin ve numuneleri en az 20 dakika kuluçkaya bırakın. %1 BSA-PBST çözeltisinde seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikor ekleyin. Her kapak kaymasını bir parafilm veya seyreltilmiş antikorun 10 mikrolitre damlacık üzerine baş aşağı yerleştirin.

Numuneleri bir nem odasında dört derecede bir buçuk saat kuluçkaya yatırın. Kapak kaymalarını 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve PBS ile üç kez yıkayın. %1 BSA-PBST'de seyreltilmiş uygun miktarda ikincil antikor ekleyin.

Her kapak kaymasını, seyreltilmiş antikorun 10 mikrolitrelik damlacıklarının üzerine parafilm üzerine baş aşağı yerleştirin. Numuneleri bir saat boyunca dört derecelik bir nem odasında kuluçkaya yatırın. Kapak kaymalarını 24 kuyu plakasına geri yerleştirin ve PBS ile üç kez yıkayın.

Son PBS yıkama çözeltisini çıkarmadan önce, kapak kaymalarını cımbız ve iğnenin yarısıyla hafifçe çıkarın ve ardından montaj ortamının damlacıkları ile cam slaytlara baş aşağı koyun. Kromatin immün önksepitasyonu, proteinlerin DNA'ya bağlanma modellerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. DSB etrafındaki bir arzu onarım proteininin doluluğunu ortaya çıkarmak için, kromatin preparatından gelen ilgi proteinini bağlı olduğu DNA bölgesiyle birlikte immünoprecipitate etmek için belirli bir antikor kullanılır.

Ayrıca, ChIP, belirli bir genomik lokusta DSB'ler tarafından kullanılan belirli çeviri sonrası modifikasyonun varlığını haritalamak için yaygın olarak uygulanmıştır. Mililitre başına yaklaşık 20 milyon hücre, her örnek için 15 santimetrelik bir tabakta kültürlenmelidir. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.

Hücreleri %1 formaldehit-PBS çözümü ile sabitleyin. Plakayı yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. 125 milimolar son konsantrasyona ulaşmak için glisine ile sabitlemeyi durdurun ve 25 derecede beş dakika boyunca hafif ajitasyon ile bir yörünge çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.

Tabağı buza yerleştirin ve buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri buz gibi soğuk PBS'de kazıyın ve 15 mililitre konik tüplere aktarın. Hücreleri 5,000 rpm'de 4 derecede beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve peletin iki mililitre hücre liziz tamponunda yeniden ıslatın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 5,000 rpm'de 4 derecede 5 dakika santrifüj. Süpernatant dikkatlice atın ve peletin 500 ila 1, 500 mikroliter nükleer lizis tamponunda yeniden süzülün ve 30 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Lisat sonikasyon için uygun bir polistiren konik tüp içine aktarın. DNA'yı ortalama 300 ila 1000 baz çifti büyüklüğünde yammak için lisat sonale. Ön temizleme ve immün özürlü adımlar için Dinamolar hazırlayın.

Ripa tamponu ile boncukları dört derecede 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Dynabeads'ı, 3.1. Her numunenin 25 ila 30 mikrogram kromatinini dört mikroliter Dynabeads ile dört derecede bir ila iki saat boyunca dönme yoluyla önceden temizleyin.

Dynabeads'ı bir mıknatısla çökeltin ve süpernatantı yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın. Her kromatin örneğine uygun miktarda antikor ekleyin ve dört derecede gece boyunca döndürün. Ertesi gün, her örneğe 40 mikroliter yıkanmış Dinamo ekleyin ve dört derecede dönen gece boyunca kuluçkaya yatırın.

300 mikroliter düşük tuz tamponu ile dört derecede dönme ile 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. Dört derecede dönme ile 10 dakika boyunca 300 mikroliter yüksek tuz tamponu ile bir kez yıkayın. 300 mikrolitre lityum klorür tamponu ile dört derecede dönüşle 10 dakika boyunca bir kez yıkayın.

300 mikroliter TE ile iki kez 10 dakika boyunca ilk yıkama için dört derecede dönme ve ikinci yıkama 25 derecede yıkayın. Boncuklara 200 mikroliter elution tamponu ekleyin ve sürekli sallanarak 15 dakika boyunca bir termo-çalkalayıcıda 65 derecede kuluçkaya bırakın. Süpernatant yeni bir tüpe aktarın ve 200 mikroliter elution tamponunda tekrar elute boncuklar.

Mililitre proteinaz-K başına 500 mikrogram ve yüzde yarım SDS ekleyin ve numuneleri iki saat boyunca 50 derecede kuluçkaya yatırın. Kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin ve üst sulu fazı yeni bir Eppendorf tüpüne aktarın. İki buçuk cilt mutlak etanol ve 0,1 hacim üç azı dişi sodyum asetat pH 5,2 ekleyin.

Eksi 80 derecede en az 20 dakika kuluçkaya yatır. Etanol çıkarın ve peletin havasını kurutun. Peletin 50 mikroliter TE'de yeniden süz. DNA üzerindeki özel dağılımlarını incelemek için kromatin immün önksepitasyon uygulanmalıdır.

ChIP-qPCR tarafından elde edilen tipik bir deneysel sonuç, I-PpoI kaynaklı DNA hasarına yanıt olarak gama histone AX'in zamansal zenginleştirmesini gösteren bu şekilde sunulmuştur. Görüntünün sol kısmında, zamanında tespit edilen gama histone AX sinyali kırılma tarafında gösterilirken, sağ kısımda gama histone AX dağılımı, gösterilen kırılmaların indüklenmediği kontrol gen bölgesinde sunulur. DNA onarımı nispeten yeni bir araştırma alanı olmasına rağmen, hem biyokimyasal hem de mikroskobik yöntemlerin yardımıyla bilgimiz hızla artmaktadır.

Bununla birlikte, Batı blotu, immünosellik ve kütle spektrometresi gibi biyokimyasal teknikler çok miktarda hücre gerektirir. Çalışma onarım süreçleri, istenen hücre popülasyonunun anlık görüntüsünü temsil eder. Mikroskobik alan, DNA hasarına bağlı hücresel süreçlerin nükleozomal düzeyde görselleştirilmesini sağlayan ve protein birlikte lokalizasyonunun doğru bir şekilde haritalanmasını sağlayan süper çözünürlüklü mikroskop gibi yüksek çözünürlüklü tekniklerle devrime uğradı.

Öte yandan, kromatin immünopipitasyon, özellikle istenen DNA onarımı ile ilgili proteinlerin genom çapındaki bağlama desenini ve kromatin veya heterokromatin bölgelerindeki çift iplikçik kırılmalarını görselleştirmek için dizileme yöntemleriyle birleştirerek güçlü bir araçtır.