Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

Merhaba, jove"video hoş geldiniz. Sizi, Leeds'te geliştirmekte olduğumuz zaman çözülmüş bir çalışma olan hızlı şebeke yapımı için burada bulunan kurulumla tanıştırmak istiyoruz. Bunun standart bir sistem olmadığını unutmayın, ancak size yaptığımız tüm şeylerin ve parametrelerin ayrıntılı bir hesabını vererek, kendi laboratuvarlarınızda benzer sistemler geliştirebileceğinizi umuyoruz.

Cihazın ayrıntılı bir açıklaması Richmond protokolünde verilmiştir. Burada, hızlı ızgara hazırlığı ve zaman çözümlü EM için adım adım bir kılavuz vereceğiz. Deneyimlerimize göre, protein konsantrasyonu mililitre başına iki miligram veya daha yüksek olmalıdır. Protokol yaklaşık 50 mikrolitrelik minimum hacim gerektirir.

Cihazı açın. Ardından kontrol bilgisayarını açın ve kontrol yazılımını başlatın. Her şırınna pompasının başlatma düğmesine basarak tüm şırınna pompalarını başlatın.

Potentiometre güç kaynağını açın, dokuz volta ayarlayın ve osiloskop kontrol yazılımını başlatın. Spreyi üretmek için basınçlı azot gazına ihtiyaç vardır. Azot silindirini açın ve basıncı 2 bar'a ayarlayın.

Tüm şırınd pompa vanalarının yük konumunda olduğundan emin olun. Bunu yapmak için, tüm vanaları kontrol yazılımında dağıtacak şekilde değiştirin ve ardından yüklemeye geri dönün. Tüm şırındları sıfıra ayarlayın.

Sistemde bulunan hava kabarcıkları bu aşamada çıkarılmalıdır. Bunu yapmak için şırınnaların sökülmeleri, kabarcıkların manuel olarak çıkarılması ve şırınnaların daha fazla kabarcık içermediğinde tekrar monte edilmesi gerekebilir. Sıvı taşıma sistemi genellikle suda depolanır.

Örneği yüklemeden önce, sistem tampon ile dengelendirilir. Bu, borunun fazla tamponla yıkanmasıyla yapılır. Şırınga bir üzerine en az 200 mikrolitre tampon içeren bir tüp yerleştirin.

Takmak için tüpün üst kısmı delinmelidir. Kontrol yazılımını kullanarak şırınga ile 50 ila yüz mikrolitre arasında uygun miktarda tamponu epire edin. Dağıtmak için bir valf değiştirin.

Tüm sıvıyı şırınd bire dağıtın. Bir vanayı yük konumuna getirin ve sistemi bir sonraki yıkama döngüsüne hazırlamak için şırınna bir üzerindeki başlatma düğmesine basın. Bu adımlar, borunun iyice yıkanmasını sağlamak için genellikle üç kez tekrarlanır.

Daha sonra, püskürtme nozülesi konumlandırılmıştır. Dalgıç koluna bir EM ızgarası yerleştirin. Izgarayı püskürtme nozülüne yerleştirin.

Kontrol yazılımını kullanarak tampon dağıtın. Nozül ve ızgara hizalanmışsa, püskürtmeden sonra uzun bir süre sıvı birikmelidir. Gerekirse, nozül pozisyonunu ayarlayın ve ardından sıvının ızgarada nerede biriktiğini tekrar kontrol edin.

Ardından, etan kabının konumunu ayarlayın. Cımbızın ucu yaklaşık olarak etan kabının ortasına ulaşmalıdır. Tüm ayarların doğru olduğundan emin olmak için bir test çalışması gerçekleştirin.

Nem odasını kapatın. Pistonun yolunun açık olduğundan emin olun. Şırınd birine tek bir çalıştırma için gereken arabellek hacmini aspire edin.

Dağıtmak için bir valf değiştirin. Denetim yazılımında run tuşuna basarak çalıştırmayı başlatın. Şırınga pompasının hareket ettiğini kontrol edin, bu durumda iki saniye, ve ızgara uygun bir gecikmeden sonra, burada 1,5 saniye dalmış.

Çalışma tamamlandığında, piston kolundaki basıncı istediğiniz değere ayarlayın. Dalma kolundan gelen basıncı serbest bırakmak için kontrol yazılımında Tamam'a basın. Şimdi etan kabı serin ve sıvı etan ile doldurulur.

Kullanmadan önce ızgaraları kızdırma deşarjı. Tipik bir kızdırma deşarjı, 0,1 milibar havada 10 miliamperde 90 saniyedir. Boru daha sonra numune ile dengelendirilir.

Mevcut numune hacmi düşükse, boru sadece bir ölü hacimle dengelenebilir. Aspirat örneği. Tipik olarak ölü hacim yaklaşık 30 mikrolitredir.

Dağıtmak için bir valf değiştirin. Numuneyi boru ve nozülden dağıtın. Ardından, tek bir çalıştırma için gereken örnek miktarını epire edin.

Dağıtmak için bir valf değiştirin. Bağıl nemin istenen değere ulaşmış olup olmadığını kontrol edin. Şebekeleri genellikle %60 veya daha yüksek bir seviyede hazırlarız.

Bu birkaç dakika sürebilir. Dalma koluna parıltılı bir ızgara tutan cımbızları yerleştirin. Potentiometre kaydırağını hız ölçümüne hazır olarak başlangıç konumuna getirin.

Osiloskop yazılımında hız ölçümü için tetikleyiciyi ayarlayın. Sıvı etan kabını yerleştirin ve nem odasına yakın yerleştirin. Pistonun yolunun açık olduğundan emin olun.

Çalıştırmayı denetim yazılımında başlatın. Çalışma tamamlandığında, dalgıç kolundan basınç bırakmak için kontrol yazılımında TAMAM'a basın. Nem odasını açın, dalma kolu ve cımbız arasındaki bağlantıyı gevşetin.

Izgarayı sıvı etan içinde tutarken dalma kolunu yukarı hareket ettinin. Daha sonra ızgaraları sıvı nitrojene ve depolamaya aktarın. Osiloskop ölçümünü kaydedin.

Potentiometre kaydırıcısının ve pistonunun konumunu manuel olarak sıfırlayın. Çoğaltma ızgaraları hazırlamak için iletişim kuralını yineleyin. Zaman çözümlenmiş deneyler de benzer şekilde yapılır.

Karıştırma adımındaki seyreltme nedeniyle zaman çözümlenmiş deneyler için daha yüksek stok konsantrasyonlarına ihtiyaç vardır. Zaman çözümlenmiş bir deneme için üç şırınnayı da kullanın. Boru şırıngam pompalarına ve püskürtme nozülüne tutturulur.

Burada kullanılan mikroakışkan sprey nozülü de bir karıştırma elemanı içerir. Daha uzun tüplerin daha büyük bir ölü hacim vereceğini ve yıkama denge adımlarının daha fazla tampon ve numune gerektirdiğini unutmayın. Tüm şırınnaları tampon ve numune ile ayrı ayrı dengele.

Tipik olarak, Şırınd bir örnek A için kullanılır ve iki ve üç şırınna örnekleri için kullanılır B'Boru eş ayarlandıktan sonra, örnek A'yı şırınna bir ve örnek B'yi şırındlara yükleyin. Ardından, dağıtmak için vanaları bir ila üç arasında değiştirin. Çalıştırmayı denetim yazılımında başlatın.

Zaman çözümlenmiş bir deneme için farklı bir çalıştırma komut dosyası gerektiğini unutmayın. Farklı zaman gecikmeleri iki şekilde elde edilebilir. Piston hızını ayarlayarak, karıştırmadan donmaya kadar olan süre gecikmesi değiştirilebilir.

Daha hızlı bir dalma hızı daha kısa bir zaman gecikmesine yol açacaktır. Alternatif olarak, sprey nozülün dikey konumu ayarlanarak sprey etan mesafesi değiştirilir. Mesafenin artırılması daha uzun bir zaman gecikmesi ile sonuçlanacaktır.

Düşük büyütmedeki elektron mikroskopunda tipik bir ızgara böyle görünür. İnce buz alanları, belirtildiği gibi, veri toplama için uygundur. Daha yüksek büyütmelerde, parçacıklar açıkça görülmelidir.

Apoferritin gibi bir test örneği ile, tek bir ızgaradan nispeten küçük bir veri kümesi, üç ila dört angstrom çözünürlükte bir yeniden yapılandırma için yeterlidir. Zaman çözümlenmiş denemeler için farklı zaman noktalarından veya ızgaralardan veri kümeleri toplarız. 3D sınıflandırma için verileri birleştirmek ve ardından parçacıkları zaman noktalarına kadar izlemek yararlıdır.

Bu şekilde veriler reaksiyon kinetiği hakkında yapısal bilgi ve bilgi sağlayabilir. Sonuç olarak, videonun hoşunuza gitmiştir. Video ile birlikte JoVE makalesindeki ayrıntılı açıklamalarla, mutasyondan kaynaklanan bazı sorunları hafifletmek veya hava suyu aralığında etkileşimlere yardımcı olmak için gösterilen hızlı ızgara yapımı yoluyla kendi deneylerinizi gerçekleştirebileceğinizi umuyoruz, bu denge olmayan durumlardan bazılarını denemek ve hapsetmek için kendi zaman çözümlenmiş çalışmalarınızı yürütmek için ihtiyacınız olan her şey.

Mutlu ızgara yapımı.