Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı
28 Mart 2021
Glioma kök hücreleri (GSC' ler), en yaygın ve yıkıcı primer beyin tümörü olan glioblastomda (GBM) tümör başlatma, anjiogenez ve ilaç direncinde önemli roller oynayan kanser hücrelerinin küçük bir kısmıdır. GSC'lerin varlığı GBM'yi hedeflenen ajanların çoğu için çok refrakter hale getirir, bu nedenle potansiyel etkili kombinasyon terapötiklerini tanımlamak için yüksek verimli tarama yöntemleri gerekir. Protokol, sinerjik etkileşim ile potansiyel kombinasyon tedavisi için hızlı tarama sağlamak için basit bir iş akışını açı
Glioma kök Hücreleri, gliomadaki hücrelerin genellikle kemoterapi ve radyoterapiye dirençli alt popülasyonudur. Burada farklılaştırılmış glioma hücreleri yerine glioma kök hücrelerini hedef alan kombinasyon tedavilerinin hızlı tanımlanması için yöntemi tanımladık. Zahmetli ve karmaşık olabilecek diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında.
Bu protokol, potansiyel yararlı ilaç kombinasyonlarını tanımlamak için nispeten basit ve hızlıdır. Glioma kök hücrelerini veya GSC'leri kültür ortamından toplayarak ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 70 kez G'de santrifüjleyarak başlayın. Süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede dört dakika boyunca accutase ile sindirin.
200 mikroliter ucu kullanarak, hücreleri ayrıştırmak için tekrar tekrar pipetlayın ve hücre peletini yeniden biriktirin. GSC'leri bir mililitrelik kültür ortamında 200.000 hücre yoğunluğunda, 12 kuyu kültür plakasının her kuyusuna ekleyin ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakanın her kuyusuna 30 mikrolitre luciferaz-eGFP virüs süpernatantı ekleyin.
Hücreleri iki saat boyunca 1000 kez G'de, 25 santigrat derecede santrifüj edin ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, GSC'leri toplayarak, santrifüj ederek, süpernatantı çıkararak, taze ortamda yeniden oluşturarak ve yeniden sıçratarak kuyulardaki ortamı değiştirin. Hücreleri 48 saat daha kültüre edin.
Plakayı floresan mikroskop altında gözlemleyin ve GFP pozitif hücrelerin görünümünü onaylayın. Akış hücresi sıralayıcısı kullanarak yüksek floresanlı GSC'leri sıralayın ve toplayın ve daha fazla kültüre edin. Kat, matrigel gibi hücre dışı matris karışımına sahip 96 kuyu optik alt plaka ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatır.
Fazla karışımı çıkarın ve plakaları PBS ile bir kez hafifçe durulayın, ardından XG387-Luc hücrelerini 100 mikrolitre kültür ortamında 1000 hücre yoğunluğunda ve kaplanmış plakaların her kuyusuna koyun ve bir gecede kültüre edin. Ertesi gün, plakaya bağlanmalarını onaylamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra kültür ortamında 200 mikromoler temozolomid çözeltisi ve hedeflenen ajanların iki mikromolar çözeltisini hazırlayın.
Kombinasyon ilaç taraması için, boş ortamı çıkarın ve tedavi başına üç teknik çoğaltma için her kuyuya 200 mikromoler temozolomid veya iki mikromolar hedefli ajan veya her ikisinin bir kombinasyonunu içeren ortamı ekleyin. Plakayı üç gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyolüminesans görüntülerini alın.
Yerleşik yazılımı kullanarak, ilgi alanının birden fazla dairesel alanını oluşturun ve hücresel biyolüminesansı ölçün. Temozolomid'in antiglioblastom etkisini artırabilecek potansiyel adayları belirlemek için ilaç kombinasyonu taraması ile 20 hedef seçici küçük molekül inhibitörü analiz edildi. Hedeflenen 13 ajanın hassas indeks değerleri sıfırın üzerinde, beşi ise 0,1'in üzerindeydi.
İlk iki aday ilaç UMI-77 ve A 83-01'in hassas endeksi 0,25'ten yüksekti ve bu da temozolomid ile sinerji oluşturma potansiyellerini gösteriyor. Temozolomid ve UMI-77'nin kombine tedavisi altı ila altı doz titrasyon matrisinde anti-proliferatif bir test kullanılarak değerlendirildi. Birleşim dizin değerleri birden azdı.
Ve yüksek tek ajan değerleri, farklı konsantrasyonlarda temozolomid ve UMI-77 kombinasyonlarının çoğu için sıfırdan büyüktü. Hem XG387 hem de XG328 GSC'lerde temozolomid ve UMI-77'nin genel sinerjik etkileşimini önermektedir. Bu protokol, sadece plaka kaplama adımını çıkararak yapışık kanser hücreleri kullanılarak ilaç kombinasyonunun bulunmasında da uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, glioblastoma (GBM) içindeki glioma kök hücrelerini (GSC'ler) hedefleyen sinerjik ilaç kombinasyonlarının hızlı tanımlanması için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. İş akışı, GSC'lerin konvansiyonel tedavilere karşı gösterdiği direnci aşmayı amaçlayarak, kombinasyon tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için lusiferaz etiketli GSC'ler, matrigel kaplı plakalar ve yüksek kapasiteli biyolüminesans tabanlı tarama yöntemini kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kanser biyolojisi
- Kök hücre araştırmaları
- İlaç keşfi
- Nöroonkoloji
Arka Plan
- Glioma kök hücreleri, glioblastoma tümörleri içinde yer alan ve tümör başlatılmasına, anjiyogeneze ve tedaviye karşı dirençe katkıda bulunan bir alt popülasyondur.
- GSC'ler tekil ajan hedefli tedavilere karşı oldukça dirençlidir, bu da kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesini gerekli kılmaktadır.
- GSC'lerde ilaç taraması için kullanılan geleneksel yöntemler genellikle zahmetli ve karmaşıktır.
- GSC'lere karşı etkili ilaç kombinasyonlarını belirlemek için hızlı ve verimli tarama protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- GSC'leri hedefleyen potansiyel sinerjik ilaç kombinasyonlarını taramak için basit ve hızlı bir iş akışı oluşturmak.
- Protokolün, standart tedavilerin anti-glioblastoma etkisini artıran kombinasyonları belirleme yeteneğini doğrulamak.
- Protokolün hem GSC'ler hem de adherent kanser hücreleri için uygulanabilirliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Yerleşik hücre hatlarından gliyom kök hücrelerin izolasyonu ve kültürü.
- Biyolüminesans görüntüleme için GSC'lerin lusiferaz-eGFP virüsü ile transdüksiyonu.
- Akış sitometrisi kullanılarak GFP-pozitif GSC'lerin ayrıştırılması.
- İlaç taraması için GSC'lerin matrigel kaplı 96 kuyucuklu plakalara ekilmesi.
- Teknik tekrarlarda temozolomid, hedeflenmiş ajanlar veya bunların kombinasyonları ile tedavi.
- IVIS spektrum görüntüleme sistemi kullanılarak hücresel biyolüminesansın miktar tayini ve hassas indeks ile kombinasyon indeksi değerleri kullanılarak ilaç sinerjisinin analizi.
Temel Sonuçlar
- Yirmi hedefli küçük molekül inhibitörü, temozolomid ile kombinasyon halinde taranmıştır.
- On üç ajan pozitif hassasiyet indeksi değerleri göstermiş, bunlardan beşinin değeri 0,1'i aşmıştır.
- UMI-77 ve A 83-01, temozolomid ile en yüksek sinerjiyi göstermiştir (hassasiyet indeksi > 0,25).
- Temozolomid ve UMI-77 için kombinasyon indeksi değerleri birden küçük çıkmış, bu da birden fazla GSC hattında sinerjik anti-proliferatif etkileri göstermiştir.
Sonuçlar
- Tanımlanan protokol, GSC'leri hedefleyen sinerjik ilaç kombinasyonlarının hızlı ve verimli bir şekilde belirlenmesini sağlar.
- UMI-77 ve A 83-01, GBM'de temozolomide ile kombinasyon tedavisi için gelecek vaat eden adaylardır.
- Bu iş akışı, plaka kaplama adımı atlanarak aderent kanser hücreleri için de uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Alaka Düzeyi
Gliom kök hücrelerini (GSC'ler) hedefleyen sinerjik ilaç kombinasyonlarının hızla tanımlanması, glioblastoma (GBM) tedavi geliştirme sürecindeki kritik bir darboğazı gidermektedir. Bu iş akışı, yüksek dirençli tümör başlatıcı hücrelere karşı kombinasyon stratejilerinin riskini azaltmak için yüksek kapasiteli ve kantitatif tarama imkanı sunar. Bu tür taramaların süreçlerin erken aşamalarına entegre edilmesi, GBM ve diğer refrakter kanserler için öngörü güvenini ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar&D
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- GSC kaynaklı direnç mekanizmalarına odaklanan terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Hastalıkla ilişkili kök hücre popülasyonlarında ilaç sinerjisinin doğrudan test edilmesiyle biyolojik risk azaltımını destekler.
- Kantitatif canlılık ve proliferasyon okumaları aracılığıyla fonksiyonel hedef validasyonunu kolaylaştırır.
- GBM portföylerindeki kombinasyon rejimlerinin ilerletilmesi için prediktif güvenilirliği artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Güçlü downstream tarama iş akışları için valide edilmiş lusiferaz etiketli GSC sistemlerini hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik için matrigel kaplı plaklar ve teknik replikalar kullanarak deney koşullarını standardize eder.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi ve karşılaştırması için kantitatif biyolüminesans çıktıları üretir.
- Birden fazla ilaç kombinasyonunun paralel olarak ölçeklenebilir ve yüksek kapasiteli taranmasını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel süreklilik için tarama çıktılarını hastalıkla ilgili GSC biyolojisiyle hizalar.
- Kombinasyon tedavilerinin preklinik GBM modellerine riskten arındırılmış bir şekilde ilerletilmesini destekler.
- Birden fazla hasta kaynaklı GSC hattında sinerjiyi doğrulayarak mekanistik risk azaltma sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu tarama iş akışı, hasta kaynaklı GSC'lerde ilaç sinerjisinin hızlı ve kantitatif değerlendirmesini sağlayarak erken keşif ile öncü bileşik belirleme aşsaları arasında köprü kurar. Elde edilen veriler, GBM kombinasyon terapileri için preklinik önceliklendirme ve translasyonel biyobelirteç stratejilerine temel oluşturur.
- Keşif Biyolojisi: GSC kaynaklı dirençte hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Bileşik ön elemesi için tekrarlanabilir, kantitatif biyolüminesans verileri sağlar.
- Analitikler: Farklı koşullar arasındaki sinerjiyi karşılaştırmak için hassas indeks ve kombinasyon indeksi değerleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hasta kaynaklı GSC'lerin kullanımı ve adherent kanser hücreleri için uyarlanabilir protokollerle hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Onkoloji portföyleri genelinde kombinasyon taraması için yeniden kullanılabilir ve ölçeklenebilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kombinasyon tedavisi geliştirme sürecinde öngörü güvenilirliğini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir iş akışlarıyla tarama süreçlerini optimize eder.
- Stratejik Değer: Sinerjik kombinasyonlara erkenden odaklanarak daha iyi devam/durdurma kararları alınmasını ve sermaye verimliliğini sağlar.
- Portföy Etkisi: Gelecek vadeden GBM tedavilerinin risk ayarlı önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- GSC kültürü, viral transduksiyon ve hücre ayırma için akış sitometrisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Kantitatif okumalar için biyolüminesans görüntüleme sistemlerine ve analitik yazılımlara erişim gereklidir.
- Deney düzeneğinin ve veri analiz protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Plaka kaplama ve hücre hazırlama adımları değiştirilerek diğer kanser modellerine uyarlanabilir.
- Hasta kaynaklı GSC hatlarının ve valide edilmiş bileşik kütüphanelerinin mevcudiyetine bağlıdır.
