Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi
16 Ağustos 2021
Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılır.
Doğru Ortalama Kare Yer Değiştirme Yönteminin Görüntülenmesi, canlı bir numunedeki hedef biyolojik nesnenin hem yapısını hem de dinamik ortalama özelliklerini aynı anda çıkarabilir. Doğru Ortalama Kare Yer Değiştirmeyi görüntülemek, tek nesne yörüngelerini çıkarmaya ve karmaşık etiketlemeye gerek kalmadan hızlı ve sağlam bir prosedürdür. Sadece standart bir optik kurulum ve floresan etiketli bir ilgi nesnesi gerektirir.
Yöntem, kanser, diyabet veya nöro-dejeneratif bozukluklar gibi çeşitli patolojik durumlarda hücre altı nano-yapılar düzeyinde bulunan yapısal ve dinamik değişikliklerin büyük ölçekli, kantitatif taramasına yol açmaktadır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Fabio Azzarello olacak. Hücreleri alt kültürlemeye başlamak için, 10 santimetrelik doku kültürü ile muamele edilmiş bir konfluent hela hücresi kabını, 0.01 molar PBS ile iki kez yıkayarak başlayın.
Daha sonra, 1 mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve kabı beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ayrılan hücreleri 9 mililitre tam DMEM ortamında yeniden askıya alın ve santrifüj tüpünde tripsin ile 10 mililitre toplam ortam toplayın. Her 35 milimetre x 10 milimetre çanakta yaklaşık 0,2 milyon hücreyi tohumlayın ve son orta hacmi 1 mililitredir ve daha sonra hücreleri inkübe edin.
İlgilenilen hücre altı yapısına bağlı olarak, belirli bir etiketleme yöntemi gereklidir ve etiketleme çözeltisi hazır olduğunda, hücreleri 0.01 molar PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi boya reaktifi içeren ortam ile değiştirdikten sonra, üreticinin tavsiyesine göre kabı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, deneyden önce hücreleri iki kez taze bir ortamla yıkayın.
Hızlandırılmış seri alımını gerçekleştirmeden önce, mikroskop inkübatör kontrol sistemini açın ve mikroskopun yaklaşık iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dengelenmesine izin verin. Transfekte hücrelerde EGFP'nin uyarılması için 488 nanometrelik bir argon lazer ve floresan etiketli Makropinozomlar kullanın ve standart bir fotoğraf çarpanı tüp dedektörü kullanarak 500 ila 600 nanometre arasındaki floresan emisyonunu toplayın. Floresan boyayı uyarmak için 543 nanometre helyum neon lazer kullanın ve 555 ila 655 nanometre arasındaki emisyonu toplayın.
Algılama iğne deliğinin çapını bir Eri boyutuna ayarlayın. Ve her edinme için bir dizi 1000 sıralı çerçeve toplayın. 129 milisaniyelik bir kare süresi için piksel bekleme süresini piksel başına 2 mikrosaniye olarak ayarlayın.
Edinimlerin araçsal parametrelerini düzgün bir şekilde başlatmak için iMSD'yi açın. Yazılım metin editörü ile M. N'as için zaman serisindeki kare sayısını, mikrometre cinsinden piksel boyutunu ve saniye cinsinden zamansal çözünürlüğü f'as değerlerini yazarak parametreleri ayarlayın.
Ayrıca, ham görüntüleri işlemek için filtre arka plan düzeltme girişini sıfıra veya eşik tabanlı bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirmek için bir taneye ayarlayın. Ardından, arka plan düzeltmesi için AV geçiş ücreti eşiğini ayarlayın. Filtre değeri bir olarak ayarlanırsa, yoğunluğu eşik değerinden daha düşük olan pikseller sıfır olarak ayarlanır.
Ardından, biti yoğunluk örneklemesini belirleyen tamsayı sayısı olarak ayarlayın. Düzenlenen iMSD'yi kaydedin ve çalıştırın. M komut dosyası.
Komut penceresinde komut dosyasının yürütülmesini kontrol edin ve herhangi bir sorun oluşursa, kesintiye uğramış uyarı mesajı görüntülenecektir. Başarılı komut dosyası yürütmesinden sonra, görüntü yığınını içe aktarın ve gerekirse arka planı çıkarın. Ardından, Fourier yöntemini kullanarak spacio-temporal korelasyon fonksiyonunu hesaplayın.
Uzay-zamansal korelasyon fonksiyonunu 2B Gauss fonksiyonu ile eşleştirin. Ardından, kullanılan farklı bağlantı denklemi türleri için üç ayrı panelde görüntülenen IMSD eğrisi ve karşılık gelen bağlantı eğrileri ile grafik çıktıyı kontrol edin. R-kare değerleri grafik göstergesinde sağlanır.
Ardından, metin çıktısını kontrol edin. Lizozomun bir test organeli olarak görüntü alımı, canlı hücrelerde uygun zamansal çözünürlükte ve çok düşük zamansal çözünürlükte gerçekleştirildi. Organel hareketine bağlı olarak lizozomun yapay deformasyonu, düşük çözünürlüklü görüntüde görülebiliyordu.
Noktanın yoğunluk profili, görüntü analiz yazılımındaki bir çizgi aracı kullanılarak türetilmiştir. Daha sonra, nokta çapı tahmini, yoğunluğu bir Gauss fonksiyonu ile çizerek ve enterpolasyon yaparak gerçekleştirildi. Yüksek hızda satın alma, sabit numuneye yakın karşılaştırılabilir bir ortalama yapı boyutu sağladı.
Bunun yerine, yavaş bir hızda edinim, görüntüleme sırasındaki doğal yapı dinamikleri nedeniyle yapı boyutunu arttırdı. Makropinozomların yapısal ve dinamik özellikleri, kaçakçılık sırasında gözlemlenmiştir. Gözlemler, Makropinozomların ortalama boyutunda bir azalma olduğunu ortaya koydu.
Alt difüzyon hareketindeki eşzamanlı artış, azalmış alfa değerleri ile gösterilmiştir. Her edinim için, zamanla Makropinozomların sayısındaki artış gözlenmiştir. Buna karşılık, ISG'ler üzerinde yapılan benzer ölçümler, bu son organellerin Makropinozomlara kıyasla çok farklı bir davranışını ortaya koymuştur.
Aslında, insülin granülleri değişmemiş, ortalama yapısal veya dinamik özellikler gösterir, bu da sabit bir durumda incelendiklerini düşündürür. Yöntem, iki ayrı hücre altı organel farklı şekilde etiketlenirse, çift renk modunda kolayca uygulanabilir. Bu durumda, çapraz korelasyon analizi, hücre içindeki iki nesnenin potansiyel dinamik etkileşimlerini vurgulayacaktır.
Genel Bakış
Bu çalışma, makropinosomları incelemek ve bunların zaman içindeki dinamik ve yapısal özelliklerini vurgulamak için Görüntüleme türevli ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizini kullanmaktadır. Makropinosomlar, zamana bağlı değişken davranışlarını daha stabil organellerinkinden ayırt etmek amacıyla insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Mikroskopi
- Hücre altı dinamikleri
Arka Plan
- Makropinozomlar, zamanla değişen yapısal ve dinamik özellikler sergiler.
- İnsülin salgı granülleri, zamanla değişmeyen özelliklere sahip nesneler için bir referans görevi görür.
- Bu farklılıkların anlaşılması, çeşitli patolojik durumlar hakkında içgörü elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme tabanlı ortalama kare yer değiştirme analizi
- Canlı hücre modelleri
- Floresan işaretlemeli standart optik düzenekler
Ana Sonuçlar
- Çalışma, makropinosomların ortalama boyutunda bir azalmanın yanı sıra zamanla artan sub-difüzyonel hareketi ortaya koymaktadır.
- Buna karşılık, ISG'ler kararlı yapısal ve dinamik özelliklerini korurlar.
- Bu bulgular, benzer koşullar altında farklı organellerin sergilediği zıt davranışları vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Bu araştırma, hücre altı yapılardaki dinamik değişimlerin değerlendirilmesinde iMSD yönteminin etkinliğini kanıtlamaktadır.
- Kanser ve diyabet gibi hastalıklarla ilişkili hücresel süreçlere dair değerli bilgiler sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Sektör Uygunluğu
Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD), hücre altı nanoyapıların yapısal ve dinamik özelliklerinin nicel değerlendirmesine olanak tanıyarak hastalıkla ilgili sistemlerde hedef doğrulamayı destekler. Bu yöntem, makropinozomlar gibi zamanla değişen organelleri, insülin salgı granülleri gibi kararlı yapılardan ayırt ederek mekanizmik risk azaltma sağlar. Bu yetenek; kanser, diyabet ve nörodejeneratif bozuklukların preklinik modellerindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Trafik yapan nanoyapıların boyutunu, difüzyonunu ve anomali katsayısını nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standart optik düzeneklerle uyumlu, etiketsiz ve trajektörden bağımsız analiz yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kantitatif iMSD imzaları aracılığıyla, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Tek nesne takibi gerektirmeyen spatiotemporal fluktuasyon spektroskopisi ile analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sorunlarını çözer.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Patolojik koşullar altında hücre altı nanostructures yapıların yapısal ve dinamik değişikliklerini tespit ederek hastalığın önemini vurgular.
- Operasyonel Değer: Organel gelişiminin boylamsal izlenmesine olanak tanıyarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan süreçte süreklilik sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hücre altı dinamiklerin kantitatif ve çoklu okunabilir çıktılarını sağlayarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: iMSD izlerinden ortalama yapısal ve dinamik parametreleri çıkararak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Herhangi bir optik düzeneğe ve floresan işaretlemeye olan uyumluluğu ile analiz hazırlığı ve ölçeklenebilirliği tanımlar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmaya olanak tanıyan boyut, yerel difüzyon ve anomalik katsayı ölçümlerini vurgular.
- Translasyonel Araştırma: iMSD imzalarını kanser ve diyabet modellerindekile patofizyolojik durumlarla ilişkilendirerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi, farklı hastalık alanlarındaki sübhücresel nano-yapıların büyük ölçekli taraması için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tahmin güveni, hedef doğrulaması, hücre içi taşıma çalışmalarında mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Canlı hücre görüntüleme platformları genelinde standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: İlaç keşfinde daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve geç aşama biyolojik risklerin azaltılması.
- Portföy Etkisi: Kantitatif organel dinamiklerine dayalı riskle uyumlu önceliklendirme ve geliştirme kararları.
Uygulama Hususları
- Floresan mikroskopi ve görüntü analizi alanlarında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları, standart optik düzenek ve iMSD analiz yazılımını içerir.
- Tutarlı parametre ayarları ve arka plan düzeltmesi için ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Hedef nanoyapıların uygun floresan işaretlemesi yoluyla farklı model sistemlere adaptasyon değerlendirmeleri.
- Pratik kısıtlamalar arasında zamansal çözünürlüğe olan bağımlılık ve düşük görüntüleme hızlarında oluşabilecek artefaktal deformasyonlar yer almaktadır.
