RNA Aptamerleri ve Riboswitch'leri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması

Bu protokolün önemi, DNA plazmit şablonlarını yarı geçirgen biyouyumlu mikrokapsüllere hareketsiz hale getirerek DNA kodlu sensörleri işlevsel tutmak için bir araç sağlamasıdır. Önerilen DNA immobilizasyon tekniği çok yönlüdür. Farklı in vitro aktivasyon mekanizmalarına sahip çok işlevli biyosensörlerin üretilmesine izin verir.

Bu mikrokapsüllerin, uygun algılama elemanları ile birleştiğinde, biyofilmler ve organlar gibi farklı ortamlarda sinyal moleküllerinin salınması da dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabileceğini öngörüyoruz. Bu teknik, mikro ölçekte biyolojik sistemlere, özellikle DNA'nın hareketsiz hale getirilmesinin ve moleküler kalabalıklaşmanın gen aktivasyonunun kinetiğini ve mekanizmasını nasıl etkileyebileceğine dair içgörüler sağlayabilir. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpündeki 300 mikrolitrelik mikropartiküllere bir mililitre polietilenimin çözeltisi ekleyerek polietilenimin ana tabakasının kurban silika veya SiO2 mikropartikülleri üzerine biriktirilmesiyle başlayın.

Karışımı, ortam koşullarında dakikada 800 devirde bir ThermoMixer üzerinde çalkalayın. Mikropartikülleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. 15 dakika sonra, mikropartikülleri bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen deiyonize su ile dört kez oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.

Daha sonra, DNA plazmitlerinin konsantrasyonunu DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile mikrolitre başına 50 ila 200 nanogram arasında ayarlayın ve DNA'yı polietilenimin astarlı mikropartiküller üzerinde biriktirmek için hazırlanan çözeltilerin bir mililitresini kullanın. Mikropartikül karışımını bir ThermoMixer üzerinde dört santigrat derece ve 800 rpm'de 15 dakika boyunca nazikçe çalkalayın ve ardından mikropartikülleri bir dakika boyunca 0,2 g'da santrifüjleme ile toplayın. ThyRS-GFPa1 olarak GFPa1 ile birleştirilmiş teofilin riboswitch'i kodlayan DNA plazmitleri ve BrocColi aptamerini BrocApt olarak kodlayan DNA plazmitleri için tüpleri işaretleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve mikropartikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile dört kez yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. İpek fibroin tabakasını biriktirmek için, DNA tarafından emilen mikropartiküllere sulandırılmış sulu ipek fibroin çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve karışımı ThermoMixer üzerinde 750 rpm'de 10 santigrat derecede 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Mikropartikülleri santrifüjleme ile toplayın ve daha önce açıklandığı gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile bir kez yıkayın.

Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. 0.5 mililitre DNase ve RNase damıtılmış su ekleyin ve mikropartikülleri girdap yaparak karıştırın. Ardından, mikropartikülleri bir ThermoMixer üzerinde beş dakika boyunca 10 santigrat derecede 0,5 mililitre %100 metanol ile işlemden geçirin.

Mikropartikülleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, partikülleri ThermoMixer üzerinde dakikada 750 dönüşte 10 dakika boyunca beta tabakası oluşumu için 10 santigrat derecede %100 metanol ile muamele edin. Mikropartikülleri toplamak için karışımı dört santigrat derecede bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleyin, partikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Peletlenmiş çekirdek kabuk mikropartiküllerine %8 hidroflorik asit çözeltisi ekleyerek mikropartiküllerin SiO2 çekirdeklerini çözün.

Çözünmüş partikül çözeltilerini diyaliz cihazlarına aktarın ve bir beherde deiyonize suya karşı diyaliz edin. Ardından, ipek mikrokapsül süspansiyonunu diyaliz cihazlarından yeni iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Mikrokapsül numunesinin 100 mikrolitresini sekiz kuyucuklu cam slaytlardan oluşan tek bir kuyucuğa aktarın ve kapsüllerin konfokal lazer tarama mikroskobu veya CLSM kullanarak görüntülemeden önce 20 ila 30 dakika çökelmesine izin verin.

Kapsül süspansiyonunun 100 mikrolitresini odacıklı bir cam slaytın her bir oyuğuna pipetleyin. Her bir oyuğa sırayla 300 mikrolitre florofor çözeltisi ekleyin, en düşükten en yükseğe değişen moleküler ağırlıklarda. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve karışımın, florofor çözeltilerinin difüzyonu dengeye ulaşana kadar oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, 488 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda 100x yağa daldırma hedefi kullanarak her bir kuyucuğu görüntülemek için slaydı bir CLSM'ye aktarın. Odak düzlemini ayarlayarak ilgilenilen alanı belirleyin ve en büyük çaplı daireler şeklinde görünen kapsüllere odaklanın. Hücresiz bileşenleri bir mikrokapsül örneğine sırayla ekleyerek ve tüpü dört saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ederek in vitro transkripsiyon / translasyon reaksiyonu gerçekleştirin.

488 nanometrede uyarma dalga boyunu ve yaklaşık 510 nanometrede GFP / FITC filtresi için emisyonu kullanarak bir plaka okuyucudaki floresansı kontrol edin. Son olarak, 488 ve 561 nanometrelerde lazerler kullanarak CLSM sistemindeki ipek mikrokapsülleri görüntüleyin. Çalışmada, homojen boyutu yaklaşık 4,5 mikrometre ve kabuk kalınlığı yaklaşık 500 nanometre olan sağlam ipek fibroin mikrokapaklar üretilmiştir.

İçi boş ipek fibroin kapsül kabuklarının geçirgenliği, moleküler ağırlık kesme yöntemi izlenerek analiz edildi. Bir polietilenimin ana tabakasının konsantrasyonundaki bir artış, daha geçirgen kabuklara sahip mikrokapsüllerin kolloidal stabilitesinin artmasına yol açarken, ana tabakanın ortadan kaldırılması, daha az geçirgen kabuk zarlarına sahip kapsüllerin toplanmasına neden olur. ThyRS aktivasyonu sırasında GFPa1 ekspresyon kinetiği, ipek mikrokapsüllerine yüklenen DNA plazmitlerinden, kapsüllenmemiş DNA'yı kontrol etmekten daha yüksek GFPa1 gen aktivasyonu ortaya çıkardı.

Temsili analizde, in vitro transkripsiyon, translasyon sisteminde inkübasyon öncesi ve sonrası kapsül başına 32 DNA kopyası ile yüklenmiş ipek fibroin kapsüllerinin CLSM görüntüleri görüntülendi. İpek fibroin kapsüllerinin kesitsel yoğunluk profilleri GFPa1 ekspresyonunu gösterdi. Kapsül başına 30 DNA kopyası ile yüklenen 20 katmanlı ipek mikrokapsülün transkripsiyon kinetiği, kontrol kapsüllenmemiş DNA ile karşılaştırıldı.

İpek mikrokapsüllerden gelen eşdeğer konsantrasyonlardaki kapsüllenmemiş DNA örneklerinden daha yüksek çıkış sinyali, ipek mikrokapsüllerin etkinliğini doğruladı. Bu protokolü takiben, immobilize durumda DNA dolaşıklığını ve in vitro olarak ayrıştırılmış gen aktivasyon sürecini görüntülemek için birkaç yüksek çözünürlüklü mikroskopi tekniği uygulanabilir. Bu teknik, minimal yapay hücrelerde moleküler düzeydeki dinamikleri yanıtlamak için uygulanabilir.

Spesifik olarak, uygun gen elementleri ile birleştiğinde, mikrokapsüller hücreden hücreye iletişimi incelemek için kullanılabilir.