E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma
27 Ağustos 2021
Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Faj görüntüleme sadece klinik olarak önemli enzimlerin bağlayıcı özelliklerini araştırmamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bu enzimler ve ilgili hastalıklar için modülatörler geliştirir. Faj ekranı, çok çeşitli hedef proteinler için yeni bağlayıcılar geliştirmek için kullanılabilir ve diğer geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre daha kolaydır. Bu prosedür çok fazla tekrarlayan eylem içeriyordu, bu nedenle anahtar otomatik pilot olmamak ve boyunca odaklanmak.
Tohum kültürünün 200 mikrolitresi ile 30 mililitre 2YT tetrasiklin suyu aşılayarak başlayın. Bakteriler orta kütük evresinde olana kadar 200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede yaklaşık üç saat kuluçkaya yatırın. Kaplama solüsyonunun plakadan bir lavaboya atılması.
Kağıt havlularla hafifçe kurulayın. Ardından, iyi kaplanmış her bir kuyuya 200 mikrolitre PB arabelleği ekleyin. PB tamponu tabaktan atın ve kağıt havlularda kurulayın.
Plakanın her kaplamalı kuyusuna 200 mikrolitre pb tampon daha ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün, sonra PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin.
Polietilen glikol sodyum klorür çözeltisini seyreltilmiş kütüphane hacminin beşte birine ekleyin ve çözeltiyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi 11.000 kez G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek ve faj peletini konsantre etmek için iki dakika daha santrifüjleyin.
Faj peletini analiz edilecek hedef protein başına bir mililitre PBT tamponunda hafifçe yeniden diriltin, genellikle toplamda dört. Kontrol plakasındaki her bir iyi kaplanmış faj kütüphanesine 100 mikrolitre ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.
PB tamponu hedef plakadan lavaboya atın ve plakayı kağıt havlularda kurulayın. Kontrol plakasındaki faj kütüphanesinin 100 mikrolitresinin tamamını hedef plakanın her kaplamalı kuyusuna aktarın. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.
Ardından, faj kütüphanesini plakadan çıkarın ve kaplanmış kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve son tampon damlalarını çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun. Fajı elute etmek için her bir kaplamalı kuyuya 100 mikrolitre 0,1 molar hidroklorik asit ekleyin.
Plakayı oda sıcaklığında 300 RPM yörünge sarsıntısı ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her iyi kaplanmış kuyuya 12,5 mikrolitre pH 11 molar tris hidroklorür ekleyerek pH'ı nötralize edin. Elde edilen fajı sekiz kuyudan tek bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı. Son konsantrasyonu yapmak için elde edilen fajlara%10 BSA ekleyin %1 Mikrosantrifüj tüpünü dört santigrat derecede saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.
Bir ağar plakasından izole edilmiş bir E.coli kolonisi ile beş mililitre 2YT tetrasiklin tohum kültürünü aşılayarak bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatır. Hedef proteini uygun miktarda PBS ile iki ve üç tüplü turlarda seyreltin.
İkinci ve üç tüplü mermilerin içeriğinin yarısını alın ve hedef protein başına dört kuyuyu bir sonraki tur için 96 kuyu bağlama plakasında kapla. Daha sonra, üç mililitre orta kütük faz hücresini aşılamak için yuvarlak bir çıkışın yarısını kullanın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
Mililitre başına 10 milyar PFU'luk son konsantrasyona M13KO7 yardımcı faj ekleyin. 200 RPM yörünge sarsıntısı ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yatır. Bir saat sonra, kültürün üç mililitresinin tamamını 30 mililitre 2YT karbenisilin kanamycin çözeltisine aktarın.
200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede bir gecede büyüyün. UBE4B'ye karşı her yerde bulunan varyant seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. UBV'ler en yüksek frekanstan en düşük frekansa sipariş edildi.
Diziler, UBV'deki çeşitlendirilmiş ubiquitin bölgesini tüm randomize kalıntılarla temsil eder. Bağlayıcıların yabani tip hedef proteine, mutasyona uğramış hedef proteine ve hedef dışı proteinlere göreli bağlayıcılığı enzime bağlı immünorbent tahlilleri veya ELISA ile ölçülür. Tüm ELISA absorbansları 96 ortalama BSA ELISA puanına ve 96 ortalama GST ELISA puanına göre normalleştirildi.
Koyu yeşil, daha güçlü bağıl bağlamayı temsil eder. Hedef protein GST etiketli olduğundan GST spesifik olmayan bağlama için bir kontrol olarak dahil edildi. ELISA sonuçları grafiksel olarak burada sunulmaktadır.
x ekseni UBV'leri, y ekseni ise karşılık gelen normalleştirilmiş absorbansı temsil eder. Bu prosedürü denerken, hidroklorik asidi ekledikten sonra çözeltiyi plakaya atmamanız önemlidir. Fajlar artık çözelti içinde askıya alınmıştır ve bunları saklamak istersiniz, böylece sonraki zenginleştirme son analizlerini veya her ikisini de gerçekleştirebilirsiniz.
Bu işlemi takiben UBV frekanslarını belirlemek için sıralama yapılmalıdır. ELISAs ve IC50 tahlilleri sırasıyla bağlayıcı etkileri ve inhibitör etkileri belirlemek ve ayrıca hangi UBV'lerin daha fazla karakterize edileceğini belirlemeye yardımcı olmak için yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ubiquitination süreçlerinde görev alan E3 ligazları modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için fage display yönteminin kullanımını ele almaktadır. Ubiquitination, çeşitli insan hastalıklarıyla bağlantılı olan kritik bir translasyon sonrası modifikasyondur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Protein Mühendisliği
Arka Plan
- Ubikitinilasyon, protein yıkımının ve hücresel süreçlerin düzenlenmesi için temel öneme sahiptir.
- Ubikitinilasyonun düzensizleşmesi birçok hastalıkla ilişkilidir.
- Faj displeyi, protein etkileşimlerini keşfetmek için güçlü bir tekniktir.
- Bu yöntem, enzimler için spesifik modülatörlerin geliştirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Faz display yöntemiyle yeni ubiquitin varyantları izole etmek.
- Bu varyantların E3 ligaz aktivitesini nasıl etkileyebileceğini anlamak.
- Ubiquitin modülasyonunun hastalık bağlamlarındaki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteri kültürlerinin 2YT tetrasiklin besiyerine inokülasyonu.
- Orbital çalkalamalı inkübatörde 37 °C'de inkübasyon.
- Bağlanma analizleri için faj displey tekniklerinin kullanımı.
- Ubikvitin varyantlarının izolasyonu ve karakterizasyonu.
Temel Sonuçlar
- Yeni ubiquitin varyantlarının başarılı izolasyonu.
- E3 ligazlara karşı kanıtlanmış bağlanma özellikleri.
- Bu varyantların ubiquitination modellerini modüle etme potansiyeli.
- Ubiquitination'ın hastalık mekanizmalarındaki rolüne dair öngörüler.
Sonuçlar
- Faj displayı, ubiquitin varyantlarını keşfetmek için etkili bir yöntemdir.
- E3 ligaz aktivitesinin modüle edilmesi terapötik etkiler yaratabilir.
- Bu bulguların klinik uygulamalarını araştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Faj displeyi odaklı ubiquitin varyantlarının (UbV'ler) mühendisliği, ubiquitin-proteazom sistemi araştırmalarında hedef doğrulama için kritik bir dönüm noktası olan E3 ligazların hassas modülasyonuna olanak tanır. Bu yaklaşım, E3 ligaz biyolojisinin mekanistik risk azaltımı ve fonksiyonel sorgulanması için yüksek afiniteli ve spesifik bağlayıcılar üreterek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır. Elde edilen UbV'ler, downstream analiz geliştirme ve translasyonel araştırmalar için güçlü araçlar sağlayarak portföy eleme ve önceliklendirme süreçlerini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Artırılmış afinite ve özgüllüğe sahip mühendislik ürünü UbV'ler kullanarak E3 ligaz fonksiyonunun sistematik olarak sorgulanmasına olanak tanır.
- Yaban tip ile mutant veya hedef dışı proteinler arasında ayrım yapan varyantları izole ederek biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
- Yinelemeli seleksiyon ve zenginleştirme yoluyla hedef etkileşimi ve mekanistik çalışmalarda öngörülebilir güvenilirliği kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bağlanma ve inhibitör etkinliğini belirlemek amacıyla ELISA ve IC50 analizlerinde kullanılmak üzere valide edilmiş UbV'ler sağlar.
- Birden çok seleksiyon turu boyunca UbV-hedef etkileşimlerinin tekrarlanabilir, kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi ve tarama iş akışları için analiz standardizasyonunu ve ölçeklenebilirliğini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Aşağı akış karakterizasyonu ile desteklendiğinde, translasyonel biyobelirteç çalışmaları için mühendislik ürünü UbV'leri hastalıkla ilişkili E3 ligazlarla hizalar.
- Seçilen UbV'lerin daha ileri fonksiyonel ve inhibitör profillenmesini sağlayarak, keşif aşamasından preklinik validasyona kadar sürekliliği korur.
- Yolak sorgulama için spesifik moleküler araçlar sağlayarak preklinik modellerdeki mekanistik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu fago görüntüleme platformu, erken keşiften öncü madde tanımlamaya kadar olan süreci entegre ederek, E3 ligaz modülatörleri için hem hipotez testlerini hem de kantitatif assay geliştirmeyi desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Yinelemeli seçme ve zenginleştirme işlemleri, E3 ligaz bağlanma yolaklarını netleştirir ve hedef etkileşimini doğrular.
- Tarama: UbV'ler ile yapılan ELISA ve IC50 analizleri, sonraki değerlendirmeler için tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Dizileme ve absorbans normalizasyonu, UbV bağlanma profillerinin ve seçim frekanslarının güçlü bir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Karakterize edilen UbV'ler, bağlanma ve inhibisyon verileriyle desteklendiği üzere, hastalıkla ilgili daha ileri çalışmalara aktarılabilir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Faj ekrana sunma iş akışı, farklı E3 ligazlara ve diğer protein hedeflerine uyarlanabilir olduğundan platform ölçeklenebilirliğini destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: E3 ligaz hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için bağlayıcı seçimini ve analiz geliştirmeyi standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/dur kararlarına ve doğrulanmış hedeflerin sermaye açısından verimli şekilde ilerletilmesine olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Keşif programları genelinde E3 ligaz modülatörlerinin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Faj dizilimi, protein mühendisliği ve kantitatif bağlanma analizleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Bakteri kültürü, faj işlemleri ve ELISA cihazlarına erişim gerektirir.
- Seçim, yıkama ve analitik protokollerin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Uygun kütüphane tasarımı ile çeşitli E3 ligazlara ve hedef proteinlere uyarlanabilir.
- Zayıf veya çok yönlü bağlayıcıların zenginleşmesini önlemek için titiz yıkama ve seçime bağlıdır.
