Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Genetik araştırmalar, insan genom diziliminin yayınlanmasından büyük ölçüde faydalanmıştır. Pyro sekanslama; genetik varyasyonun yanı sıra RNA alelik dengesizliği, DNA metilasyon durumu ve gen kopya sayısının analiz edilmesine olanak tanıyan benzersiz bir sistemdir. Bu videoda, genetik analiz için temel bir pyro sekanslama reaksiyonunu gösteriyoruz.

Merhaba, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Bölümü'nden Dr. Charles Eby ve Dr. Brian Gage laboratuvarından Kristy King ben. Bugün size pirosekanslama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedür, SNP'leri analiz etmek için kullanılan en kapsamlı ancak basit yöntemlerden biri olduğu için oldukça kullanışlıdır.

Pyro sekanslama, bir nükleotidle açık bir üç prime DNA zincirine her ekleme yapıldığında pirofosfat salınımından yararlanan sentez yoluyla sekanslama yöntemine dayanır. Plaka yüklendikten sonra, nükleotidler yazılım tarafından sağlanan bir sıraya göre eklenir. Salınan pirofosfat, bir ATP salınımıyla sonuçlanan bir reaksiyonda kullanılır; ATP ise lüsiferaz tarafından lüsiferi oksilüsifere dönüştürmek için kullanılır ve bu durum ışık yayımıyla sonuçlanır. Alınan ışık bir CCD kamera tarafından toplanır ve pirolar olarak da bilinen pikler şeklinde kaydedilir.

DNA zincirine dahil edilmeyen nükleotitler, arka plan gürültüsünü önlemek için AP pyra ile degrade edilir. Bu prosedür şu adımları içerir: Assay tasarımı, kalite kontrolü için PCR jel elektroforezi ve piro sekanslama.

Öyleyse pirosekanslama işlemine başlayalım. Pirosekanslama gerçekleştirmek için öncelikle bir PCR ürünü hazırlanmalıdır. Pirosekanslama için yapılan PCR, tüm primerlerin tüketildiğinden emin olmak amacıyla çoğu PCR'dan daha fazla döngü, yaklaşık 50 döngü gerektirir.

Pyro sekanslama ayrıca PCR primerlerinden birinin biyotinlenmiş olmasını gerektirir. Son olarak, dahili bir primerin de gerekli olduğunu belirtmek önemlidir. Kontaminasyon bulunmadığından emin olmak için pyro sekanslama aracılığıyla sağlanan yazılımlarla etkili assay tasarımı gerçekleştirilebilir.

PCR ürününün mevcut olduğunu doğrulamak için, birkaç örneğin yanı sıra bir negatif kontrol üzerinde jel elektroforezi yapılmalıdır. Piro sekanslama plakası hazırlamak için 96 kuyucuklu piro sekanslama plakasına 12 µL piro sekanslama primer karışımı ekleyin. Bunun için 43,2 µL internal primer ile 1396,8 µL annealing buffer karışımı gereklidir; piro sekanslama plakasını yapışkanlı film ile kapatın.

Kurulumun 50 dakikadan uzun süreceği durumlarda, 96 kuyucuklu PCR ürün plakasının her bir kuyucuğuna; 240 µL streptavidin kaplı sero bead'ler, 560 µL bağlanma tamponu (tris, sodyum klorür, EDTA ve tween 20'den oluşur) ve 3.600 µL su içeren 70 µL SRO hızlandırma karışımı ekleyin ve kapağı güvenli bir şekilde kapatın. Boncuk karışımı içeren 96 kuyucuklu PCR ürün plakasını oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin.

Kuyucuklar arasında herhangi bir çapraz kontaminasyonu önlemek için kapağın sıkıca kapatıldığından emin olun. Bu adım, strep ENC ile kaplı spheros boncuklarının PCR primeri üzerinde bulunan biyotin etiketine tamamen bağlanmasını sağlayacaktır. Plakaların hazırlanması için bir çalışma alanı oluşturun.

Buna reaktif olukları, PCR ürünü ve boncuk karışım tepsisi ile piro sekanslama primer tepsisi dahildir. Negatiflerin aynı yönde olması için PCR ürünü ve boncuk karışım plakasının yanı sıra piro sekanslama primer tepsisinin uygun şekilde hizalandığından emin olun. Örnekleri aktarmadan önce, üzerinde bulunabilecek boncukları veya kalıntıları serbest bırakmak için kapalı durumdaki vakum aracını temiz su içinde sallayın.

Kalan suyu boşaltın, hazneyi yeniden doldurun ve vakumu çalıştırın. Tüm su uzaklaştırılana kadar vakum aracını hazne içinde bırakın; bu işlem yaklaşık 30 saniye sürer. Vakum aracının filtre uçlarını PCR boncuk karışımı plakasının kuyucuklarına yerleştirin ve plakadaki tüm sıvı uzaklaştırılana kadar orada bekletin.

Yüzey gerilimini önlemek için hafifçe sallama işlemi uygulanabilir. Sıvı tüplerden akmaya başladığında vakumu %70 etanol teknesine yerleştirin. Filtre uçlarının etanolü beş saniye boyunca çekmesine izin verin.

DNA'yı tek zincirli PCR haline getirmek için 0.2 molar sodyum hidroksit ve yıkama tamponu için işlemi tekrarlayın. PCR ürününü temizlemek ve nötralize etmek için. Vakum hortumunu vakum aracından ayırın ve vakum aracını, dizeleme tamponu karışımı içinde pirosekizleme primerini içeren pirosekizleme plakasına yerleştirin.

Vakum hortumu hala bağlıysa, pirosekanslama plağına yerleştirildiğinde primer karışımı içeri çekilecektir. Uçlar, PCR ürününüzün kaybına neden olur. PCR ürününüzü dağıtmak için vakum uçlarını pirosekanslama plağının kuyucukları içinde nazikçe sallayın veya sarsın.

Sallama veya çalkalama işlemi tamamlandığında vakum aparatını pirosekizleme plakasından çıkarın, vakum aparatını hortuma yeniden bağlayın ve bir sonraki plaka için temizlemek üzere aparatın temiz su içine yerleştirin. Pirosekizleme plakasını iki dakika boyunca 80 °C'de bir ısıtma bloğuna yerleştirin. İki dakika sonra plakayı ısıtma bloğundan çıkarın ve soğuk bir yüzeye yerleştirin.

Plaka soğuduktan sonra, eğer plaka buharlaşmayı önlemek için 15 dakika içinde çalıştırılmayacaksa, plakayı kapatmak için yapışkan film kullanılabilir. Artık pirosekanslamaya başlama zamanı geldi. Pirosekanslamanın ilk adımı, analiz detaylarını bilgisayara girmektir.

Simplex girişi altında, yeni girişi seçin ve kimlik adı ile analiz edilecek dizilim dahil olmak üzere analiz bilgilerini girin; bu bilgiler, kalite kontrolü sağlamaya olanak tanıyan ve SNP çevresindeki dizilimi artı kontrol bazlarını sunan analiz tasarım yazılımı tarafından sağlanır. Son olarak, pikrogramınızın nasıl görünmesi gerektiğine dair görsel bir sunum sağlamak için histogramları seçin. Şimdi bir SNP çalışması girme zamanı.

Snip runs ve genel sekmesi altında, bir çalışma adı girin ve çalışma için cihaz parametrelerini seçin. Kurulum sekmesi altında, analiz girişini seçin ve plaka üzerinde tıklayıp sürükleyin. Seçtiğiniz analizi plakanıza yerleştirirken, tüm plakanın kullanılması gerekmediğini, analiz için farklı kuyucukları etkisiz hale getirebileceğinizi ve aynı plaka üzerinde birçok farklı analizin yürütülebileceğini belirtmek önemlidir.

Görünüm sekmesine tıklayın ve ardından Çalıştır'ı seçin. Bu sayfa, çalışma için gerekli olan nükleotid, enzim ve substratın uygun hacimlerini listeler. Kullanmadan önce hem nükleotid veya kapiler hem de reaktif uçlarını temizleyin.

Uçları suyla doldurun ve herhangi bir tıkanıklık olup olmadığını kontrol etmek için ucun üst kısmına basınç uygulayın. Eğer ucun altından su çıkmıyorsa, suyu zorlayarak geçirmek için birkaç kez boşaltıp tekrar doldurun. Ayrıca, uç hala tıkalıysa uçları sonikasyon işlemine tabi tutabilirsiniz.

Uçları atın ve yenilerini alın. Enzim ve substrat kullanımdan önce su ile yeniden süspande edilmelidir. Çalkalandığında uç tıkanıklıklarına veya tutarsız dağıtıma neden olabilecek hava kabarcıkları oluşabileceğinden, yeniden süspande edilmiş ancak kullanılmamış enzim ve substrat eksi 20 derece Celsius'ta saklanabilir.

Kılcal dağıtım uçlarının bir mikro santrifüj tüpünde gelecekte kullanımı için, nükleotidler ve TE tamponu P8 ile bire bir oranında seyreltme yapın. Kullanmadan önce iyice karıştırın. Nükleotid ve reaktif uçlarını, yazılım tarafından önerilen miktarlara göre uygun hacimlerle doldurun.

Pipet uçlarına hava kabarcığı girmesini ve bunun sonucunda tıkanmalar oluşmasını önlemek için sıvıyı uçların kenarlarından yavaşça dağıtın. Nükleotid dağıtım uçlarında hava kabarcığı olup olmadığını mutlaka kontrol edin. Eğer hava kabarcığı varsa, kabarcıklar yüzeye çıkana kadar uçların kenarlarına hafifçe vurun veya temiz bir pipet ucuyla bunları uzaklaştırın.

Kartuşu doldurduktan sonra bir test plağı çalıştırın. Kartuşu pirosekanslama cihazına, test plağını ise 96 kuyucuklu plaka platformuna yerleştirin. Plağın üzerine yapışkan bir film yerleştirmek, reaktiflerin ve nükleotidlerin dağıtımının kolayca görülmesini sağlar.

Ekranın sol tarafındaki cihaz sekmesini seçin, ardından yönet'e tıklayın. Açılır menüden cihazı seçin. Test'e tıklayın; bir uyarı görünecektir.

Test plakasının cihaza yerleştirildiğini kontrol etmeniz istenmektedir. Tamam'a tıklayın. İşlem tamamlandığında test plakasını çıkarın; plakanın ortasında dört nükleotidi, enzimi ve substratı temsil eden altı kuyucuğun üzerinde sıvı damlacıklar olmalıdır.

Altı küçük noktadan daha azı varsa, bir tıkanıklık meydana gelmiş demektir ve uçlar kontrol edilerek tüm tıkanıklıklar giderilmelidir. Plakayı piro dizileme 96 kuyucuklu plaka platformuna yerleştirin. Tüm kolları kapatın ve ilgili plaka için çalıştır (run) düğmesine tıklayın.

Çalışmayı başlatın; enzim, substrat ve nükleotidler önceden belirlenen sırayla dağıtılacaktır. Çalışma pyro sequencer tarafından analiz edildikten sonra, sonuçları inceleme zamanı gelmiştir. Mavi kuyucuklar, başarılı bir genotip ve pyro sonucunu temsil eder.

Turuncu kuyucuklar insan müdahalesi gerektirir; ilgili kuyucuğa tıklayıp öngörülen histogramı açarak düzenleme yapılabilir. Bir genotip geçebilir, başarısız sayılabilir veya kontrol edilebilir; ayrıca genotipin kendisi uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kuyucuk düzenlendiğinde, plaka haritasında koyu bir daire görünecektir.

Negatif kontroller negatif olarak skorlanmalıdır. Negatif kuyucuklarda spesifik olmayan pikler görülebilir; ancak bu durum genellikle dahili primerin döngü yapmasından kaynaklanır. Böylece size, insan genomik DNA'sındaki bir polimorfizmin nasılPyrosequencing yöntemiyle dizileneceğini göstermiş olduk.

DNA Pyro sekanslama, geniş bir uygulama yelpazesine uyarlanabildiği için diğer sekanslama prosedürlerine göre kullanışlıdır. Ayrıca düşük konsantrasyonlu ve degrade olmuş DNA dahil olmak üzere her türlü kaynaktan gelen DNA'yı işleyebilecek kadar dayanıklıdır. Bu prosedürü uygularken, işleme temiz ve kaliteli bir PCR ürünü ile başlamayı hatırlamak önemlidir.

Her analiz için bir negatif kontrol ekleyin ve tüm reaktiflerinizin uygun olduğundan emin olun. İşte her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.