Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Bu protokol, x-ışını kırınım verilerinin hatırlanmasında çip benzeri bir cihazda protein kristalleşmesini gösterir. Bu cihaza kristal üzerine kristal denir, çünkü protein kristalleri tek bir kuvars kristali üzerinde büyür. Bu tür cihazlarda protein kristallerinin başarılı bir şekilde büyümesi üzerine, protein kristallerine dokunmadan oda sıcaklığında her cihazdan binlerce kırınım görüntüsü toplanır.

Oda sıcaklığında X-ışını kırınımı, birçok konformasyonel durumu içeren protein fonksiyonunu incelemek için çok önemlidir. Bu bilgilendirici protein değişiklikleri veya protein eylemleri dondurulabilir, böylece kriyo-kristalografide tespit edilemez. Bu cihazlar, ışık kaynaklı sinyalizasyon süreçlerini ve redoks değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.

Yalnızca birkaç cihaz tam ve yedekli veri kümeleri verir. Cihaz ön montajına başlamak için, numune tanımlama için dış halkayı etiketleyin. Proje adını, cihaz numarasını, kristalleşme koşulunu ve tarihi istediğiniz gibi ekleyin.

Ardından etiketli halkayı temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirin ve dış halkanın içine bir kuvars gofret yerleştirin. Daha sonra, bir Petri kabına az miktarda mikroskop daldırma yağı dökün ve şimin her iki tarafının da iyi kaplandığından emin olmak için bir şimin yağa batırın. Şimleri temiz bir yüzeye sürterek fazla yağı temizleyin.

Ardından yağlı şimleri ilk kuvars gofretin üzerine yerleştirin. Protein çözeltisini ve kristalizasyon tamponunu bir pipet kullanarak ilk kuvars gofret üzerinde karıştırın. Karıştırırken hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın.

Kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, dolgu boyutu ve kalınlığı tarafından belirlenen kristalizasyon odasının maksimum kapasitesini aşmamalıdır. İkinci kuvars gofreti karışık çözeltinin üzerine yerleştirin. Çözüm kendiliğinden yayılacaktır.

Ardından, havayı dışarı iterken yağın yayılmasına yardımcı olmak için ikinci kuvars gofrete hafifçe kenardan dokunun. Bir tutma halkasını dış bileziğe vidalayarak cihazı sabitleyin. Gerekirse, bir sıkma aleti kullanın.

Hassas kuvars gofretlerin deforme olmasına veya çatlamasına neden olabileceğinden aşırı sıkmadan kaçının. Monte edilen cihazları oda sıcaklığında bir kutuda veya sıcaklık kontrollü bir inkübatörün içinde saklayın. Birkaç saat veya gün sonra, kristalleşme cihazını mikroskop altına yerleştirin ve kristal büyümesini izleyin.

Gerekirse, kristalleşme koşullarını makalede açıklandığı gibi optimize edin. Kalibrasyon için, talaş tutucuya ince bir YAG kristali takın, ardından kiriş durdurucuyu takın. Ardından, Insitux yazılımını açın ve cihazın kristalizasyon cihazı ve cihazı için kullanıcı tarafından seçilen bir isim olduğu doğrudan ışının x-ışını floresan görüntülerini almak için belirtilen programı çalıştırın.

param, aygıta özgü denetim parametrelerini içeren dosya adıdır. Ardından, yanık görüntüsünün x-ışını floresan görüntüsünün dosya adı olduğu ışın profili uygulama programını çalıştırarak doğrudan x-ışını ışınının kesin konumunu bulun. Optik tarama için, talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı yerleştirin ve bir parmak vidası kullanarak sabitleyin.

Daha sonra talaş tutucuyu kinematik bir mekanizma aracılığıyla difraktometrenin çeviri aşamasına monte edin. Protein örneğinin ışık hassasiyetine ve deneyin amacına bağlı olarak, cihazın optik penceresinden mikrograf çekmek için beyaz veya kızılötesi bir ışık kaynağı takın. Kurulum hazır olduğunda, ışın hattında hareket halinde tarama için belirtilen komutu girerek tarama programını çalıştırın.

Ardından, döşeme programını, x'in sütunun başlangıç değeri olduğu ve y'nin mikrografların sahte yer değiştirmeleri için başlangıç değeri olduğu bir kullanıcı bilgisayarında çalıştırın. Program, tüm mikrografları bir ila üç mikrometre piksel çözünürlüğünde bir montaja diker. Mikrografları diktikten sonra, kristal bulma programını çalıştırmak için belirtilen komutu girin.

Bu program kristal tanıma ve atış planlaması gerçekleştirir ve bu programdaki temel parametreler belirli kristal seçimi ve hedef planlaması sağlar. Işık kaynağını çıkarın ve ışın durağını konumlandırın. Ardından seri kırınım için veri toplama programını çalıştırın.

Önerilen komut, planlanan çekimleri önceden programlanmış bir sırayla ziyaret ederek veri toplamayı tetikler. Hedeflenen her kristal ışın konumuna taşınır. Her durakta, x-ışını maruziyeti, planlanan bir zaman gecikmesinde lazer aydınlatmalı veya lazer aydınlatmasız olarak alınır.

Çalışmada, buhar difüzyonu ile çip üstü parti arasındaki kristalleşme koşulları karşılaştırılmıştır. Burada çip üzerinde kristalleşme ve doğrudan kuvars cihazlarından toplanan temsili veri kümeleri ile ilgili dört vaka çalışması gösterilmektedir. Dinamik kristalografi deneyleri, karanlıkta 4.352 kristalden ve ışık aydınlatmasından sonra 8.287 kristalden elde edilen verileri karşılaştırarak uzak kırmızı fotoreseptör proteininde ışığın neden olduğu değişiklikleri ortaya çıkardı.

In situ seri Laue kırınımından gelen karanlık veri kümesi, daha iyi çözülmüş elektron yoğunlukları ile sonuçlandı ve tüm Z işareti konformasyonunda iki kromozomun güvenli bir şekilde modellenmesini sağladı. Işık kaynaklı fark haritaları, merkezi beta tabakasında, kromoforun pirrol halkaları ile birkaç aromatik kalıntı arasındaki pi-pi istiflemesinin önemini gösteren uyumlu hareketleri ortaya çıkarmıştır. Bu platforma Insiteux denir.

Bu platformun benzersiz avantajı, kristalleşme yapıldıktan sonra herhangi bir kristal manipülasyonu yapmak zorunda kalmamasıdır. Protein hareketlerini yakalamak için değişen koşullar altında birçok veri kümesi toplamak gerekir. Ve bu Insitux ile mümkün hale geliyor çünkü oda sıcaklığında binlerce protein kristalinden büyük ölçekli veri toplamayı mümkün kılıyor.

Kristalografiyi de içeren bu yeni özellik sayesinde, ışığa duyarlı sistemler cihazın içinde tetiklenebilir ve kristal üzerine kristal cihaz çıkışlara dönüştürülürse ışık inert sistemi incelenebilir.