Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

İlk olarak 2013 yılında tanımlanan berraklık tekniği, daha büyük miktarlarda hücrenin, kan damarlarının, yani proteinlerin bile kalın beyin dilimlerinde tek bir hücre çözünürlüğü gibi örneklemelerini sağlayan bir doku temizleme tekniğidir. Bu teknik, tüm beyni şeffaf hale getirerek bozulmamış mikroskobik yapıların incelenmesini sağlar. Bu protokol, doku temizliği için basit bir çip ve basit bir boru hattıdır.

Bu teknik, beyin dokularına ek olarak diğer sistemlerdeki dokuları temizlemek için kullanılabilir. Başlamak için, tüpü ve kapağı parafilm kullanarak kapatın ve kapaktaki iki deliği delin. Ardından, beş milimetre iç çapa sahip esnek bir boru ve ucuna bağlı 19 gauge iğne kullanarak azot gazını tanktan aktarın.

Boruyu tüpe bağlayarak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gaz değişimine izin vererek gaz gidermeye başlayın. Boruyu ayırın ve delikleri hemen modelleme kili ile kapatın. Daha sonra, hidrojel çözeltisini polimerize etmek için gaz giderici tüpleri 3 1/2 saat boyunca 37 santigrat derece banyoya aktarın.

Beyni tüpten çıkarın. Laboratuvar mendilleri kullanarak, beynin etrafındaki polimerize hidrojeli çıkarın ve beynin yüzeyine bağlı kalan hiçbir artık jel kalmamasını sağlayın. Beyni tüm ilgi alanlarını içeren kalın dilimlere bölün.

Dilimleri ilk temizleme çözeltisine koyun ve 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, beyni yerleştirmek için delikli bir tüp hazırlayın. Delikli tüpü, karıştırma cihazında ikinci temizleme çözeltisi ile doldurulmuş bir beherin içine koyun.

Daha sonra beyni beherin içine yerleştirin ve ağartmayı önlemek için alüminyum folyo ile kapatın. Doku şeffaf hale geldikten sonra, beyni 24 saat boyunca 70 RPM'de rotasyonla 37 santigrat derecede inkübe halinde PBST'ye aktarın. Çözeltiyi taze PBST ile değiştirin ve inkübasyona 24 saat daha devam edin.

Daha sonra beyni 24 saat boyunca oda sıcaklığında PBS'ye aktarın. 24 saat sonra, beyni PBS'den çıkarın ve kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Beyni bir gecede 37 santigrat derecede inkübe edin.

İlk olarak, örneği slaytın ortasına yerleştirin. Sıcak tutkal kullanarak, slaytın kenarlarında, neredeyse doku kadar yüksek duvarlar oluşturun. Köşelerden birinde küçük bir boşluk bıraktığınızdan emin olun.

Sıcak tutkal tabakası beyin diliminin yüksekliğine yaklaştıkça, üst yüzeyi nemlendirmek ve kabarcık oluşumunu önlemek için numune üzerine bir ila iki damla kırılma indisi eşleştirme çözeltisi uygulayın. Sıcak tutkal hala sıvı iken, üst kısmı bir kapak kayması ile kapatın, mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerleştirin ve ardından odayı kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile doldurun. Boşluğu sıcak tutkalla kapatın.

Sıcak tutkal duvarları kızağın sınırlarının ötesine uzanıyorsa, uzatma kenarlarını kesin. Görüntüleme için bir yağ daldırma hedefi kullanılıyorsa, daldırma çözeltisini korumak için kapak kaymasının üzerindeki duvarlara iki ila üç milimetre daha yapıştırıcı ekleyin. Bu protokolden sonra beyin dokusu temizlenecektir.

Fare hipokampusunun CA1 bölgesindeki astrosit ve nöron popülasyonlarını görselleştirmek için bu protokol kullanılarak berrak beyin dilimleri hazırlandı. Tüm astrositler tdTomato eksprese etti ve uyarıcı nöronlar çekirdeklerinde H2B-GFP eksprese etti. Berraklaştırılmış doku için hazırlanan oda, iki foton veya konfokal mikroskop altında görüntüleme için en uygunuydu.

İki foton mikroskobu kullanılarak, fare hipokampusunun CA1 bölgesinin temizlenmiş bir bölümünde 300'den fazla astrosit gözlendi. Kırmızı ve piramidal hücrelerdeki hipokampal astrositler, yeşil renkli somata, bu iki hücre tipi arasındaki uzamsal yakınlığı temsil eden görünür ve kalın, şeffaf dokulardı. Taramalı bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak, uyarıcı nöronlardan aksonal demetler tüm yarımküre boyunca izlendi.

Yeşil demetler dorsal hipokampustan süper mamillary cisimlere doğru izlendi. Kırmızı demetler, mamillary cisimlerden havalandırma hipokampüsündeki kökenlerine doğru izlendi. Sıcaklık, konsantrasyonlar ve inkübasyon süresi gibi faktörler netlik prosedürünün sonucunu etkiledi.

Bu nedenle, protokolün her adımındaki hassasiyet, berrak dokuya ulaşmanın başarısı için hayati öneme sahiptir. Bu tekniği kullanarak, çeşitli beyin yapılarındaki nöronlar ve astrositler arasındaki mesafeleri ölçüyoruz. Bu protokol, önceki çalışmalara göre iki ila üç büyüklük sırasına göre daha fazla hücrenin analizine izin verdi.