Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca²⁺ Geçicilerinin Analizi

Bu yaklaşım, kalp yetmezliğinin gelişimi sırasında kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri tespit eder. Miyositlerde nörohormonlara ve potansiyel terapötik ajanlara fonksiyonel yanıt da taranabilir. Miyositin konumlandırılması pratik gerektirebilir, ancak tutarlı sarkomer uzunluğu görüntülemesi elde etmek için gereklidir.

Prosedürü gösteren, doçent ve laboratuvarın baş araştırmacısı Margaret Westfall'dur. Deneye başlamadan önce, bir jel paketini ve ortamı bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika önceden ısıtın. Makalede belirtildiği gibi kontraktil fonksiyonlu platform bileşenlerini açın ve boruyu peristaltik pompaya monte edin.

Ardından, önceden ısıtılmış jel paketini tüp tutucuya aktarın ve güçteki vakumu hücre uyarıcısına açın. Peristaltik pompa borusundan dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlamak için yalıtımlı tüp tutucusuna ortam içeren 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Daha sonra, küçük bir tartım teknesine iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve miyositler içeren bir kapak kaymasını stimülasyon odasından tartım teknesine aktarın.

Stimülasyon odasını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte geri getirin. Kapak kaymasını tartım teknesinden çıkarın ve yeni yağlanmış bir kapak kayma odasına aktarmadan ve kapak kaymasına bir damla ortam eklemeden önce alt tarafı nazikçe silin. Kapak kayması üzerine bir platin elektrot montajı yerleştirin, ardından forseps ile üst kısım üzerine yeni bir kapak kayması yerleştirin ve kapak kaymalı sandviçinin üzerine bir üst montaj yeri yerleştirin.

Odanın montajını bitirmek için iki veya dört numaralı sıfır panhead vidaları takın. Peristaltik pompada, ortam boru boyunca mevcut olduğunda, boruyu ön ısıtıcıya ve ön ısıtıcıyı kapak kayma odasına takın. Daha sonra, dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak için odanın altına bir mendil mendil yerleştirin.

Kapak kayma odasını mikroskobun sahne adaptörüne yerleştirdikten sonra, ısıtma sistemini açın ve odanın merkezinde 37 santigrat derece sabit bir ortam sıcaklığı elde etmek için tertibatı beş ila 10 dakika dengeleyin. Perfüze edilmiş ortamın odanın karşı ucunda bir vakum sistemine bağlı boru ile toplandığını gözlemleyin. Dengeleme süresi boyunca, miyositleri mikroskopta 40x suya daldırma hedefi ile görselleştirin.

Pacing stimülatörü etkinleştirmek için, voltajı 35 ila 40 volta ayarlayın ve kontraktil fonksiyonu ve miyosit sağkalımını optimize etmek için stimülasyon frekansını 0.2 hertz'e ayarlayın. Sarkomer kısaltma izlerini toplamak için, bilgisayardaki yazılımı açın ve Tamam, dosya ve yeni sekmeleri seçin. İzleri seçerek, kullanıcı sınırlarını ve sarkomer uzunluğunu düzenleyerek bir ekran şablonu hazırlayın.

Sarkomer uzunluğu izlerini dosya ve yeni sekmelerle kaydedin, büzülen bir miyositi tanımlayın ve miyositi kameranın uzunlamasına ekseni boyunca konumlandırın, böylece çizgilenme paterni dikey olur. İlgilenilen bölgeyi veya ROI kutusunu miyositin üzerine yerleştirmek için bilgisayar faresini kullanın. Sözleşme işlevini kaydetmek için topla ve başlat'ı seçin.

0.5 hertz'lik düşük stimülasyon frekanslarında her miyositten 60 saniye kısalmayı kaydedin. Kapak kayması başına beş ila 10 hücreden sarkomer kısalmasını kaydedin. Bir frekans aralığında kısalmayı ölçmek için, kayıttan önce sabit durum kısalması elde etmek için miyositleri her frekansa yerleştirin.

Perfüzyon hızını iki katına çıkarın ve stimülasyondan 15 ila 20 saniye sonra 0.2 ila iki hertz aralığında yeni bir frekansta kayıt yapmaya başlayın ve verilen stimülasyon frekansları aralığında kısaltmak için kapak kayması başına ikiden fazla miyosit kaydetmeyin. Güvenilir sinyal ortalaması verileri elde etmek için hücre başına en az yedi kasılma kaydedin. Dosyayı seçin, kaydedilmiş bir izleme seçin ve ardından Aç'ı seçin.

Temel izlemelerden birini seçin ve ardından sarc uzunluğunu elde etmek için izlemenin üstündeki sarı paneli ayarlayın. İşlemler monotonik geçici analiz seçenekleri ve TTL olay işareti ile bir analiz şablonu hazırlayın T Zero tanımında menüden gerekli seçenekler. Şablonları seçerek ve analiz şablonunu bir tanımlayıcıyla kaydederek bu analiz seçeneklerini kaydedin.

Her izlemeyi çözümlemeden önce çözümleme şablonunu yükleyin. Verileri analiz etmek için işaretleri, geçidi seçin, geçici ekleyin ve ardından olay işareti ve analiz aralığından dönüştürün. 0,2 hertz'de tempolu miyositler için zaman aralığını eksi 0,01 ila 1,20 saniye arasında ayarlayın.

Daha yüksek frekanslarda uyarılan miyositler için daha kısa bir zaman aralığı seçin. Orijinal temel izlemenin altında bir sinyal ortalaması kaydı üretmek için işlemleri ve ortalama olayları seçin. Ardından, sinyal ortalaması alınan izlemeden birini seçin ve ardından üst menüdeki işaretlere gidin ve ardından geçici ekle, işlemleri ve monotonik geçici analizi seçerek sinyal ortalaması alınan ekran panelinde temel sarkomer parametreleri için sinyal ortalaması değerlerini görüntüleyin.

Monotonik geçici analizi ve pano akımını dışa aktarmayı seçin ve çoklu miyositlerin kompozit analizi için geçici sarkomer analizini bir elektronik tabloya aktarın. Sinyal ortalaması izlemesini kopyalamak için dışa aktar, geçerli izleme, ardından pano ve seçenekler sekmelerini sırayla seçin ve ondalık basamakları beş olarak ayarlayın. Sekmeler sınırlayıcısını seçin ve Tamam'ı tıklatın.

Her miyosit kaydı için sinyal ortalama izlerini ikinci bir elektronik tabloya aktarın. Çalışma, aşırı basınç veya PO'nun, sahte gruba kıyasla miyositlerin kasılma fonksiyonunu azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, kardiyak troponin IT 144D veya cTnIT144D'nin gen transferinden dört gün sonra, PO miyositlerindeki kontraktil yetenek, miyosit fonksiyonunun geri yüklenebileceğini gösteren sahte seviyelere geri döndü.

İlk çalışmalarda, cTnIT144D'nin gen transferi, CTnI'ye kıyasla pik kısalmayı ve diyastolik kalsiyum seviyelerini yükseltti. Kardiyak miyositin pozisyonunda ince ayarlamalar genellikle net kısalma izleri elde etmek için gereklidir. Bu protokol, kısalmanın yanı sıra kalsiyum geçicilerini tespit etmek için Fura-2 gibi kalsiyuma duyarlı floresan boyalarla yüklü kardiyak miyositler üzerinde de yapılabilir.