Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Mikrokabarcık aktivasyonu ve genişleme protokolü önemlidir, çünkü hücre tedavisi araştırma ve üretiminde karşılanmamış büyük bir ihtiyacı ele alır ve T hücresi tedavilerinin kalıcılığını ve etkinliğini arttırır. Akadeum'un yüzdürme tabanlı pozitif seleksiyon, aktivasyon ve genişleme tekniği, aktivasyon ve genişleme iş akışları sırasında aşırı uyarılmayı ve ardından T hücresi tükenmesini sınırlar. Başlamak için, biyotinile anti-CD3 antikoru ile 2.5 mililitre ayırma tamponunda ticari olarak elde edilen PBMC'leri 3 kez 10 ila 8.

Bileşenleri pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre, soyulmuş avidin mikro kabarcıklarını hücrelere 0,5 ila 1 oranında ekleyin. Ve 20 RPM'de ticari bir uçtan uca rotatör kullanarak oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca karıştırın.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler, soyulmuş avidin mikrokabarcıkları ile süspansiyonun üstünde olacak ve kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. Dokuz inçlik bir cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi katmanının altına tüpün altına yerleştirin.

Hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve bunları yeni bir tüpe aktarın. Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını bir mililitre tam T hücresi ortamında yeniden askıya alın. Subnatantı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj yapın ve dolaylı saflık ve geri kazanım ölçümü için kullanın.

Subnatant ve seçilmemiş hücrelerin santrifüjlenmesinden sonra, süpernatanı aspire edin ve saymadan önce peleti bir mililitre ortamda yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, parlak alan mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve metin makalesinde açıklandığı gibi kabarcık hücre katmanında yakalanan hücrelerin sayısını belirleyin. Konjuge anti-CD28 soyulmuş avidin ve mikrokabarcıkları oluşturmak için, biyotinile anti-CD28 antikorunu ticari mikro kabarcıklara ekleyin ve en az iki saat boyunca uçtan uca rotasyon kullanarak karıştırın.

Anti-CD28 konjuge strep avidin mikro kabarcıklarını hazırlanan kabarcık hücresi süspansiyonuna 1,5 ila 1 oranında ekleyin. Bileşenleri uçtan uca döndürmeyi kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın. Ardından, toplam hacmi, tam T hücresi ortamı veya elde edilen hücre sayısına göre istenen başka bir ortam ile mililitre başına 2 milyon hücreye ayarlayın.

Bir mililitre aktif hücreyi 24 kuyucuklu bir plakaya dağıtın ve nemlendirilmiş% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, sıfır gününde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, daha fazla genişlemeyi teşvik etmek için IL-2 ve çözünür anti-CD3 ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş karbondioksit inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ortamın yarısını her iki günde bir midnatanttan çıkarın. Taze, eksiksiz T hücresi ortamı ile değiştirin ve mililitre başına 50 birim konsantrasyonda IL-2 ekleyin. Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın.

Hücre yoğunluğu mililitre başına 2 kat 10 ila 6. hücreye veya 2.5 kez 10. hücreye ulaştığında, bunları mililitre başına 5. hücrelere 5 kat 10'a seyrelterek daha büyük bir kaba aktarın. Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Her bir oluğu 400 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400g'da santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden askıya alın.

Daha sonra, aktivasyon ve tükenme için 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu her biri 25 mikrolitreye bölün. Hücreleri bir aktivasyon ve tükenme antikoru boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir mililitre ayırma tamponu ekleyin, nazikçe karıştırın ve fazla antikorları yıkamak için santrifüj yapın.

Süpernatantı tamamen aspire edin. Hücre peletini bir mililitre ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi analizi için uygun bir kaba aktarın. Kontrol örneği ile mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücreler arasında canlı T hücresi sayılarında ve transgen pozitif T hücrelerinde artışlar gözlendi.

Mikro kabarcık örneklerinde artmış efektör hücre popülasyonları da gözlenmiştir. Canlı aktive olmuş T hücreleri, artmış erken aktivasyon belirteci CD69 ve orta ila geç aktivasyon belirteci CD25'i eksprese eder. PD1 pozitif hücrelerin tükenme belirteçlerinin toplam sayısı ve yüzdesi, mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücre örneklerinde de anlamlı derecede yüksekti.

Mikro kabarcıkların uygun şekilde karıştırılması ve dağıtılması, doğru dozajlamayı sağlamak için esastır, çünkü mikro kabarcıklar ajitasyon olmadan yüzeye hızla yüzer. Bunu, diğer yöntemlerde sıklıkla görülen daha yorgun T hücrelerinden daha yüksek aktiviteye sahip büyük bir T hücresi popülasyonunun hızlı büyümesini sağlayarak yapmasını bekliyoruz.