2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

FDA'daki Bilim ve Mühendislik Laboratuvarları Ofisi, tıbbi cihaz geliştiricilerine ve FDA incelemecilerine yardımcı olmak için düzenleyici bilim araçları geliştirmektedir. Nihai hedefimiz, mevcut en iyi bilim aracılığıyla hastaların yenilikçi, güvenli ve etkili tıbbi cihazlara erişimini hızlandırmaktır. Bu protokolde, hayatı tehdit eden kalp rahatsızlıklarını tedavi etmek için kullanılan tıbbi cihazların değerlendirilmesine en son indüklenmiş pluripotent kök hücre teknolojisini uyguluyoruz.

Bu basit araç, standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak çanaktaki kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca çeşitli kalp hastalıkları olan donörlerden elde edilen hastaya özgü hücrelerle de kullanılabilir. Başlamak için, çözülmüş insan iPSC'si, kardiyomiyositlerin esnek hidrojel substrat üzerine tohumlanmasından en az iki gün önce% 0.1 jelatin kaplı steril altı kuyucuklu plakalar üzerine kardiyomiyositleri türetilmiştir.

Kültür insan iPSC, kriyo-korumadan kurtulmalarını sağlamak için 37 santigrat derecede iki ila dört gün boyunca standart kardiyomiyosit ortamında kardiyomiyositleri ve% 5 karbondioksit ile türetilmiştir. Harcanan ortamı her 48 saatte bir% 100 kardiyomiyosit ortamı ile yenileyin. Hücrelerin sağlığını değerlendirerek, canlılık ve stabil dayak sağlayarak ayrışmadan önce insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin durumunu kontrol edin.

Kardiyomiyositleri, kalsiyum klorür veya magnezyum klorür olmadan DPBS kuyusu başına dört mililitre ile yıkayın. Her bir oyuğa bir mililitre oda sıcaklığı ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, steril 15 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre kardiyomiyosit ortamı ekleyin.

Kardiyomiyositleri altı delikli plakalardan 1.000 mikrolitrelik bir pipetle ayırın ve hücre süspansiyonunu konik tüpe ekleyin. Artık kardiyomiyositleri toplamak ve konik tüpe eklemek için kuyucukları bir mililitre taze kardiyomiyosit ortamı ile durulayın. Ardından, konik tüpün son hacmini ortamla birlikte 15 mililitreye getirin.

Tüpü beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir mililitre işaretine kadar çıkarın. Kardiyomiyosit ortamındaki hücreleri beş mililitrelik son bir hacme kadar askıya alın ve kardiyomiyositleri manuel veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın. Daha sonra, esnek hidrojel substratlar hazırlanırken kardiyomiyosit hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika inkübe edin.

Bir mikrolitrede 20 mikrolitrelik bir pipet seti, pipet uçları, steril 48 delikli cam alt plaka ve doku kültürü davlumbazında bir kronometre zamanlayıcısı hazırlayın. Hücre dışı matrisi veya ECM bazlı hidrojel substratı, tüpe hafifçe dokunarak ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirerek karıştırın. İlk hidrojel substratı kaplamadan hemen önce kronometre zamanlayıcısını çalıştırın ve bunu sıfır zamanı olarak işaretleyin.

Pipet ucunu soğutmak için hidrojel substratın bir mikrolitresini yaklaşık üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, seyreltilmemiş hidrojel substratın yaklaşık bir mikrolitresini, pipeti 45 derecelik bir açıyla tutarak 48 delikli plakadaki her bir kuyucuğun dibine yatay olarak uygulayın. Deneyleri 40X büyütmede gerçekleştirirken substratın tanımlanmasına yardımcı olmak için tüm hidrojel substratlarını her bir kuyucukta aynı yönde plakalayın.

Kapağı 48 delikli plakaya yerleştirin ve hücreleri eklemeden önce hidrojel substratların doku kültürü davlumbazındaki oda sıcaklığında sekiz ila 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, kardiyomiyositleri derhal hidrojel substratlara damlatın, yaklaşık 200 mikrolitre kardiyomiyosit ortamının düşük bir orta hacminde kuyu başına yaklaşık 30.000 canlı kardiyomiyosit ile tohumlayın. Kapağı kapattıktan sonra, hücrelerin hidrojel substratına yapışmasını sağlamak için kardiyomiyositlerin davlumbazdaki oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden inkübe etmesine izin verin.

Her bir oyuğa nazikçe 100 mikrolitre taze kardiyomiyosit ortamı ekleyin. Kapak kapalı plakasını iki ila dört gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. 37 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite dengelemek için mikroskop ve çevresel kontrol odasını açın.

Kardiyomiyosit ortamını 48 delikli plakadan çıkarın ve her bir kuyucuğu 600 mikrolitre kardiyak kontraktilite modülasyonu veya CCM tahlil ortamı ile iki kez hafifçe durulayın. Daha sonra kuyu başına 300 mikrolitre CCM tahlil ortamı ekleyin ve 48 delikli plakayı çevresel kontrol odasındaki mikroskop üzerine yerleştirin. Elektrotları yerleştirin ve hücreleri beş dakika boyunca dengeleyin.

Kasılma videolarını video tabanlı mikroskopi kullanarak kaydetmek için, video kayıt yazılımını açın ve saniyede 100 kare kare hızı ayarlayın. Ardından, hiPSC-CM tek katmanının merkezine yakın bir ilgi alanı veya yatırım getirisi seçin. Daha sonra alan, 2D kardiyomiyositlerin tek katmanlarını elektriksel olarak hızlandırmak için hücreleri ticari bir darbe jeneratörü ile uyarır.

Kardiyomiyositi temel nabız parametreleri ile bir hertz'de 1.5 kat eşiğe yerleştirin. Örneğin, monofazik kare dalga temposu, beş voltluk iki milisaniyelik bir uyaran darbe süresine sahip darbelerdir. Temel tempo hızını CCM'den önce en az beş vuruş için yalnızca daralma videosu olarak kaydedin.

Daha sonra kardiyomiyositlerin tek katmanlı katmanını 30 milisaniye gecikmeli deneysel bir elektrik sinyali, 5.14 milisaniye faz süresine sahip iki simetrik bifazik darbe, 20.56 milisaniye toplam süre, 10 volt faz genliği ve sıfır fazlar arası aralık ile uyarın. CCM kaynaklı kasılma videosunu en az beş vuruş için kaydedin. CCM sinyalini kapatın, temel bir tempo darbesi ile uyarın ve CCM'den sonraki iyileşme döneminin en az beş atım için bir kasılma videosu kaydedin.

Kasılma videolarını otomatik olarak analiz etmek ve kasılma genliği, kasılma eğimi, gevşeme eğimi, zirveye kadar geçen süre, başlangıç çizgisine kadar geçen süre% 90 ve kasılma süresi% 50 gibi temel kontraktil özellikleri ölçmek için standart bir kontraksiyon yazılımı kullanın 2D insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositler tek katmanlı sözleşmeli özellikler karakterize edildi ve kardiyomiyosit kontraktilitesinin anahtar parametreleri ölçüldü. Standart CCM stimülasyon parametrelerinin uygulanması, in vitro olarak gelişmiş kontraktil özellikler ile sonuçlandı. Hücre dışı kalsiyum konsantrasyon modülasyonunun CCM stimülasyonu olan ve olmayan insan kontraktil özellikleri üzerindeki etkileri değerlendirildi.

Kasılmanın beklenen başlangıç kalsiyum bağımlılığının yanı sıra, kardiyomiyosit monokatmanı seviyesinde kalsiyum duyarlılığında CCM kaynaklı bir artış gözlendi. Ek olarak, beta androjenik sinyal yolunun farmakolojik sorgulaması, CCM'nin neden olduğu inotropik etkilerin kısmen beta adrenerjik sinyalleme ile aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, bu araç, CCM'nin hastalık durumları bağlamında etkisini anlamak için dilate kardiyomiyopati de dahil olmak üzere hastaya özgü hastalık kardiyomiyositlerine genişletilebilir.

Burada, öncelikle insan kontraktil özelliklerini değerlendirmeye odaklanıyoruz. Bununla birlikte, bu aracı kullanarak, aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum kullanımı dahil olmak üzere diğer kardiyak uyarılma kasılma kuplajları da değerlendirilebilir. Bu, indüklenmiş pluripotent kök hücreyi teknoloji ile kardiyak cihazların değerlendirilmesi ile birleştiren ilk düzenleyici bilim aracıdır.

Bu alternatif yöntem, tıbbi cihazların bir tabakta değerlendirilmesinin yolunu açar ve hayvan ve insan denek testlerine olan ihtiyacı azaltma potansiyeline sahiptir.