U2 OS Hücre Kültürü Kullanılarak Canlı Hücre, Floresan Mikroskobu için Bir Elektroporasyon Sitometrisi Protokolü

Bu araştırmanın kapsamı, darbeli elektrik alanlarının hücre davranışı üzerindeki etkisine, özellikle de elektroporasyonun hücre döngüsünü nasıl etkilediğine odaklanmaktadır.

Bu protokolün birincil avantajı, memeli hücre kültürünü kullanarak 72 saate kadar sürekli canlı hücre elektroporasyon deneyleri gerçekleştirme yeteneğidir. Laboratuvarımız, bu teknikleri daha düşük numune boyutlarına, daha az reaktif gereksinimlerine ve gelecekteki protokoller için daha iyi numune kontrolüne izin verecek olan mikroakışkanlar için uyarlamaya odaklanmıştır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, U2OS FUCCI CA5 hücrelerini% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin içeren 10 mililitre DMEM yüksek glikoz ile 10 santimetrelik bir plakada kültürleyin. Plakayı %5 karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültür% 80 birleşmeye ulaştığında, medyayı plakadan aspire edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, ardından bir mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 1.5 dakika inkübe edin. Ayrışmış hücreleri beş mililitre DMEM yüksek glikoz içinde yeniden süspanse ederek tripsini nötralize edin. Yeniden süspanse edilmiş kültürden 100 mikrolitrelik bir numune alın ve elektroporasyon sitometri sistemi odasının içindeki alt cam kapak kızağına yerleştirin. Numuneyi yerleştirdikten sonra haznenin %30 birleşim halinde olduğundan emin olun. Haznenin uzak ucuna yavaşça dört mililitre DMEM yüksek glikoz ekleyin ve sıvının numuneyi dışarı atmasını önleyin. Haznenin üzerine standart bir mikroskop lamı yerleştirin ve hazneyi 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Elektroporasyondan önce sistemin stabilize olmasını sağlamak için ters çevrilmiş floresan mikroskobu bir çevresel kontrol odası ile açın. Çevre odası stabilize olurken, elektroporasyon odası ile hızlı kurulum için darbe üreteci kondansatörüne ve yüksek voltaj anahtarına dijital bir multimetre bağlamak için timsah klipsli kablolar kullanın. Şimdi, mikroskopta 20x büyütmeyi seçin. Mikroskop yazılımında, FUCCI CA594 sistemindeki iki floresan proteine karşılık gelen FITC/GFP ve A5 Texas Red M Cherry kanallarının seçildiğinden emin olun. Uzun süreli görüntüleme sırasında fotoğrafın zarar görmesini önlemek için genellikle 0,05 saniyeden az olan düşük pozlama ayarlarını kullanın. Zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmadan önce görüntü odağını ve kalitesini optimize etmek için test görüntüleri çekin. Fotoğraf hasarını azaltırken zaman atlamalı çekim başına yüksek hacimli hücre döngüsü verileri elde etmek için 24 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir üç ila altı farklı bakış açısından görüntü yakalamak için zaman atlamalı çekimi programlayın. Zaman atlamalı çekim sırasında kültür takibini optimize etmek için A594 kanalı için otomatik odaklamanın etkinleştirildiğinden emin olun. Elektroporasyon tamamlanana kadar yazılımı açık bırakın. Elektroporasyon sitometri odasını uygun bir çevre odası ile donatılmış mikroskoba yerleştirin. Elektroporasyondan önce, odayı kapalı tutun ve uygun hücre döngüsü koşullarını sürdürmek için çevresel sistemin çalışır durumda kaldığından emin olun. Çevre odasını açın ve nabız üretecine dijital bir multimetre takın, ardından timsah klipsi kablolarını kullanarak nabız üretecini hazne elektrotlarına bağlayın. Darbe üreteci kondansatörünü 180 volta kadar şarj edin. Dijital multimetre sıfır volt gösterene kadar nabzı hızlı bir şekilde hazneye boşaltın. Haznedeki tüm elektrik bağlantılarını çıkarın ve optimum kültür koşullarını sağlamak için hazne kapağını derhal değiştirin. Çevre odası güvenli bir şekilde yerine oturduğunda zaman atlamalı görüntülemeyi hemen etkinleştirin. Zaman atlaması tamamlandıktan sonra, yakalanan tüm görüntüleri tek bir video olarak kaydetmek için mikroskop yazılımını kullanın. Manuel niceleme için hücre özelliklerinin netliğini artırmak için görsel kaliteyi ayarlayın. Son olarak, hızlandırılmış videodaki hücre fazlarını izlemek için zaman içinde FITC ve A594 sinyallerindeki değişiklikleri gözlemleyin. Fuji sistemi kullanılarak, G1, S, G2, M fazlarının net bir şekilde ayırt edilmesini sağlayan, protein ekspresyonu ve ubikitinasyon ile bağlantılı renk değişiklikleri izlenerek görsel veriler toplandı. Bu, değişen koşullar altında hücre döngüsü ilerlemesinin doğrudan gözlemlenmesini sağladı. Bu şekil, senkronize edilmemiş ve S-fazı senkronize hücre kültürleri kullanılarak yapılan iki deney setinden toplanan temel verilerin bir özetini sağlar. Senkronize edilmemiş hücrelerde darbeli elektrik alan maruziyeti, G1, G2 ve M fazlarının ortalama uzunluğunu önemli ölçüde arttırırken, S fazı değişmeden kalmıştır. Senkronize hücrelerde, darbeli elektrik alan maruziyeti, G1, S ve G2 fazlarının sürelerinin azalmasına neden oldu, ancak sadece S ve G2 istatistiksel olarak anlamlıydı, ancak M fazı etkilenmeden kaldı.