Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Laboratuvarımız, nükleer gözenekler ve kromatin organizasyonu arasındaki etkileşimi inceler. Bu nedenle, nükleer gözeneklerin kromatin organizasyonunu nasıl etkilediğini, aynı zamanda kromatin organizasyonunun, özellikle nükleositoplazmik taşımada nükleer gözenek fonksiyonunu etkileyip etkilemediğini de tersine çeviriyoruz. Nükleositoplazmik taşıma çok hızlı bir süreçtir, bu nedenle zorluklardan biri, canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerindeki değişiklikleri tespit etmektir.

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşımayı izlemek için çok fazla araç mevcut değildir. Yarı otomatik ve geliştirilmiş bir teknik uygulayarak, bu araçların kullanımını kolaylaştırmayı umuyoruz. Protokolümüz derin öğrenmeye dayanmaktadır.

Hatayı sınırlar ve analiz için gereken süreyi büyük ölçüde azaltır. Daha önce bir gün sürecek olan şey artık sadece bir veya iki saat sürüyor. Başlamak için bilgisayar sisteminde FIJI yazılımını başlatın.

Görüntü birinci olarak kararlı fazı, ikinci görüntü olarak aydınlatma fazını ve üçüncü görüntü olarak kurtarma fazını seçin. Tek bir görüntü oluşturmak için üç aşamayı temsil eden üç görüntüyü birleştirin. Elde edilen, birleştirilmiş görüntüyü Dosya'ya gidip TIFF Olarak Kaydet'i seçerek segmentasyon için kaydedin.

Ardından, Görüntü, Renk ve Kanalları Böl'ü seçerek mCherry kanalını bölün. Ardından bölünmüş görüntüyü şuraya giderek kaydedin: Dosya, Farklı Kaydet, ve TIFF. Alım sırasında ağartma olup olmadığını kontrol etmek için sırasıyla Görüntü, Yığınlar ve Z ekseni Profilini Çiz'i seçin.

Ardından Veri'ye ve ardından İlk veri kümesini kopyala'ya tıklayın ve Z ekseni profil hücresinin altında sağlanan elektronik tabloya yapıştırın. Şimdi Analiz Et'e, ardından Araçlar'a ve ROI Yöneticisi'ne tıklayarak bir çekirdeğin ortalama boyutuna yaklaşan dairesel bir ilgi alanı çizin. ROI'yi ekleyin ve Diğer'e gidip Kaydet'e tıklayarak kaydedin.

Kaydedilen yatırım getirisini hızlandırılmış çekim sırasında hücresiz bir bölgeye yerleştirin. Ölçümleri Analiz Et ve Ayarla altında Ortalama gri değerin seçildiğinden emin olun. Ardından Diğer, Çoklu Ölçü'ye tıklayın.

Kontrol 50 dilimin tümünü ölçün"ve Dilim başına bir yatırım getirisi"ve yoğunluğu kaydetmek için Tamam'ı tıklayın. Ölçülen tüm yoğunluk değerlerini kopyalayıp ROI arka plan hücresinin altındaki sağlanan elektronik tabloya yapıştırın. Ardından görüntüyü yalnızca mCherry kanalıyla kapatın ve birleştirilmiş kanallarla kaydedilen görüntüyü seçin.

Şimdi sırayla Eklentiler, İzleme ve TrackMate'e tıklayarak TrackMate eklentisini açın. Zaman noktalarının sıfır ile 49 arasında olduğunu onaylayın ve İleri'ye tıklayın. StarDist dedektörünü seçin ve İleri'ye tıklayın.

Çekirdek segmentasyonu için Kanal iki, SiR-DNA'yı seçin ve işlemin tamamlanmasını bekleyin. Varsayılan parametreleri eşikleme penceresinde bırakın ve İleri'ye tıklayın. Aşırı sinyal değerlerine sahip çekirdekleri hariç tutmak için Ortalama Yoğunluk, Kanal Bir'i kullanarak filtreler oluşturun.

Tanımlanan eşiğin üzerindeki değerleri seçmek için bir filtre, eşiğin altındaki değerleri seçmek için diğerini oluşturun. Benzer şekilde, kalıntıları veya ölmekte olan hücreleri temizlemek için iki alan filtresi ekleyin ve İleri'ye tıklayın. Basit LAP izleyiciyi seçin ve İleri'ye tıklayın.

Ardından, izleme parametrelerini ayarlayın. Bağlantı maksimum mesafesini "30 mikrometreye, Boşluk kapatma maksimum mesafesini" 15 mikrometreye ve Boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğunu üçe ayarlayın. Ardından İleri'ye tıklayın.

Hesaplamalardan sonra, parçalarda filtreler ayarlamak için İleri'ye tıklayın. Yalnızca tüm zaman süreci boyunca izlenen çekirdekleri seçmek için, izdeki en yüksek nokta sayısını seçin ve İleri'ye tıklayın. Ardından, daha sonraki analizlerde her bir çekirdeği yeniden izlemek ve diğer görüntüleme özelliklerini tercih ettiğiniz gibi özelleştirmek için Spot adlarını görüntüle"yi işaretleyin.

Sayfanın alt kısmında, Parçalar'a tıklayın ve CSV'ye Aktar"ölçüm tablosunu kaydetmek için. Tabloyu kapatın ve İleri'ye tıklayarak devam edin. Şimdi üzerine tıklayın Kaplamayı yakala"bir eylem olarak ve ardından Yürüt'e ve ardından izlenen çekirdeklere sahip bir görüntü oluşturmak için Tamam'a basın.

Sırasıyla Dosya, Farklı Kaydet'e tıklayıp TIFF'i seçerek görüntüyü kaydedin. TrackMate CSV dosyasını sağlanan elektronik tabloya aktarmak için Veri sekmesine tıklayın. Dönüştürme Verilerini Al" grubu altında, Metinden/CSV'den"ve İçe Aktar'a tıklayın.

Spot IDB, Track IDC, Frame I ve ortalama yoğunluk Kanal 1M sütununu kopyalayın ve sağlanan elektronik tablonun A'dan D'ye kadar olan sütunlarına yapıştırın. Sonuçları alfabetik olarak önce B5 hücresinden İzleme Kimliğine, tek tek çekirdeğe ve ardından C5 hücresinden Çerçeveye, zaman noktasına göre sıralayın. Şimdi GraphPad Prism'i açın, yeni bir sayfa oluşturun ve elektronik tablodan zaman sütununu kopyalayıp yapıştırın. Daha sonra bağıl nükleer yoğunluk olarak elde edilen değerleri GraphPad Prizma tablosuna yapıştırın.

Bağıl nükleer yoğunluk grafiğini oluşturmak için Grafik bölümüne gidin ve grafik ailesi olarak XY'yi seçin. Sonra seç Noktalar ve hata çubuklu bağlantı çizgisi"grafik türü olarak. Çizim ayarlarında, Ortalama ve Hata"ve SEM'i seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, dışa aktarma oranını elde etmek için Yeni Veri Tablosu'na tıklayın ve yalnızca kararlı ve aydınlatma aşamaları için süreleri ondalık olarak girin.

Bu fazlar için bağıl nükleer yoğunluk olarak elde edilen değerleri tabloya yapıştırın. Sonuçlar bölümünde, XY analizine ve ardından Üstel'e tıklayın. Ardından Doğrusal olmayan regresyon'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Parametrelerin altındaki model olarak Plato'yu ve ardından bir faz bozunmasını seçin.

Ardından X0 olarak 2,25'e eşit bir sabit, Y0 olarak bire eşit bir sabit ve plato için sıfıra eşit bir sabit seçin. K'nin sıfırdan büyük olması gerektiğini belirtin ve Tamam'a basın. Yeni bir tablo oluşturun ve elde edilen K değerlerini yapıştır-transpoze edin. Grafik bölümünde, grafik ailesi olarak Sütun'u seçin ve grafik türü olarak keman çizimini seçin.

Seç Tüm noktaları göster"çizim olarak ve Tamam'a tıklayın. Optogenetik prob lexy ile nükleer ihracat, canlı hücre görüntülemede görselleştirildi. Metanolle muamele edilmiş hücrelerle kontrol koşulunda, mavi ışık aydınlatmasından sonra nükleer mCherry yoğunluğu keskin bir şekilde azaldı ve ardından aydınlatma sonrası aşamada kademeli bir iyileşme oldu. İhracat inhibitörü leptomisin B ile tedavi, prob sinyali tüm zaman noktalarında tutarlı bir şekilde nükleer kaldığı için nükleer ihracatta bir değişikliğe neden oldu.

Bağıl nükleer yoğunluğun kantitatif analizi, aydınlatma fazının sonunda bir platoya ulaşana kadar zamanla yavaş bir düşüş gösterdi. Ara leptomisin B konsantrasyonları hafif bir nükleer ihracat göstermelidir. Yoğunluk verilerinden hesaplanan ihracat oranları, metanolle tedavi edilen hücrelerde önemli ölçüde daha yüksek bir ihracat oranını, 0.5 nanomolar leptomisin B ile çok daha düşük bir oranı ve bir nanomolar leptomisin B'de neredeyse hiç ihracat olmadığını doğruladı.