Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

Eozinofil açısından zengin insan dokularında arka planı bastırmak için heparin bloklaması ve spektral algılamayı birleştiren bir IBEX iş akışını optimize ediyoruz. Otofloresans ve eozinofil granül bağlanması, gerçek sinyali belirsiz yapar. Her ikisini de temiz, yüksek plex haritalarını etkinleştirmek için hedefliyoruz.

Başlamak için, cam slaytın üzerine monte edilmiş dokunun etrafında bir daire çizerek bir pap kalem kullanarak hidrofobik bir bariyer oluşturun. Her dokuya yaklaşık 100 mikrolitre PBS ekleyerek onları yeniden nemlendirin ve slaytı oda sıcaklığında yaklaşık iki dakika kuluçka geçirerek optimal kesme sıcaklığı bileşiğini yıkayabilirsiniz. PBS'yi doku çevresinden aspire ile emici cam Pasteur pipeti ile alın.

Sonra her dokuya 100 mikrolitre bloklayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında bir nem odasında bir saat kuluçka yapın. Şimdi engelleme tamponunu pipet kullanarak aspire edin. her dokuya 100 mikrolitre boyama karıştırın ve slaytı gece boyunca dört derece Celsius sıcaklığında bir buzdolabında kapalı nem odasında kuluçka yapın.

Benzer şekilde, sadece bir florofor ile boyanmış ve negatif kontrol ile boyanmış bir bölüm hazırlanarak florofor spektrumunu ve doku otofloresansını tanımlayın. Boyama karışımını aspire ettikten sonra, mendiliyi PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra sıvıyı aspire edin. Örneği görüntüleme için mikroskopa monte edin.

Parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast modunu kullanarak numuneye odaklanın. Sonra floresans moduna geçer ve deneysel gereksinimlere göre spektral alım parametrelerini yapılandırır. Deneyde kullanılan floroforlar için uygun lazerler atayın.

Seçilen lazer çizgilerine karşılık gelen bir ışın ayırıcıyı seçin. Tüm dedektörlerin tam emisyon spektrumunu yakalamasını ve görüntü alım çözünürlüğünü önceden tanımlanmış çözünürlüklerden birine ayarlaymasını mümkün kılın. Ya da maksimum çözünürlüğü seçin.

Optimum optik kesitleme için iğne deliği boyutunu tek bir alan birimine ayarlayın. Lazer ayarlarını satın almadan önce optimize edin. Tüm işaretleyicilerle boyanmış bir bölüm kullanarak, düşük lazer gücüyle sürekli tarama moduna başlayın.

Her dedektörün ana kazancını ve lazer yoğunluklarını ayarlayın, böylece tüm işaretleyiciler iyi bir sinyal-arka plan oranıyla tanımlanabilir. Lazer yoğunluklarını ince ayar edin ve tek boyalı ile çoklu boyalı kesitler arasında tekrar ederek geçiş yapın, ta ki tüm florofor sinyalleri aşırı doygunluk olmadan görünür hale gelsin. Satın alma yazılımında karo özelliğini etkinleştirin ve doku etrafındaki karo toplama bölgesini tanımlayarak tam görüntü kapsamasını sağlayın.

Dokunun merkezindeki karo edinme bölgesi için odak noktasını optimize edin. Sonraki görüntüleme turlarında hizalanma için referans olarak hizmet edecek tanınabilir bir düzende belirgin bir hücre seti gibi benzersiz bir yapısal özellik belirlemek. Şimdi Z-stack özelliğini etkinleştirin ve Z-stack sekmesine gidin.

Orta sekme altında, dilim sayısını en az altı olarak ayarlayın ve dilimler arasında en az bir mikrometre aralık bırakın. Önceki adımda belirlenen mevcut odak noktasını yığının orta dilimi olarak ayarlamak için orta butona tıklayın. Görüntü edinimi başlatmak için denemeye başla butonuna tıklayın.

Satın alma tamamlandıktan sonra, resim küçük resmine sağ tıklayın, Save As seçeneğini seçin. Bir dosya konumu seçin ve görseli adlandırın. Görüntü verilerini güvenli depolama için yedekleyin. Görüntüyü, döşeli bölge edinirken uygulanan aynı optimize edilmiş ayarlarla un-mix'i yapın.

Her tek boyalı kontrolden bir snap yakalayın ve gerçek sinyal spektrumunu elde etmek için lekelenmemiş kontrolden arka plan veya otofloresansı yakalamak için bir snap alın. Bu görüntüleri yalnızca spektral karıştırma için kullanın. Seçilen bölgenin gerçek bir sinyali temsil ettiğini, lekelenmemiş kontroldeki yoğunluk ve morfolojinin arka plan seviyelerine eşdeğer olup olmadığını ve belirteçin lokalizasyonunun beklenen hücresel desenle (örneğin membran, nükleer, sitoplazma veya salgılanan dağılım gibi) eşleştiğini kontrol ederek doğrulayın.

Yazılımda snap görüntüyü açın. Karıştırma sekmesine tıklayın ve karıştırmamış araçlar sekmesi altından bölge seçim araçlarından birini seçin, pozitif sinyalin etrafında ilgi alanı veya yatırım getirisi oluşturarak o bölgenin spektrumunu oluşturun. Her üretilen spektrumu ilgili floroforun teorik emisyon spektrumuyla karşılaştırın.

Bölgenin gerçek sinyali doğru şekilde temsil ettiğinden emin olun. Her spektrumu florofor kimliğine göre adlandırın ve spektral veritabanına kaydedin. Sonra, fayanslı görüntüyü yükleyin ve karıştırma aracını açın.

Plus tuşunu kullanarak her floroforun referans spektrumlarını karıştırma listesine ekleyin. Spektral sinyalleri ayırmak ve karıştırılmamış görüntüyü kaydetmek için doğrusal karıştırma düğmesine tıklayın. Ağartma çözeltisini bir buharlı davlumbazda hazırlayın.

Mikro spatula kullanarak, 10 miligram lityum borohidriti doğrudan kuru bir beaker'e tartın. Dikkatlice 10 mililitre ultra saf su ekleyin ve bileşik tamamen çözünene kadar karıştırın. Her doku bölümüne yaklaşık 100 mikrolitre yeni hazırlanmış ağartıcı çözeltiyi cam Pasteur pipeti ile ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında duman başlıkta 15 dakika kuluçka yapın.

Ağartıcı parlak menekşe ölürse, slaytı dikkatlice epifloresan mikroskopa taşıyın ve dappy filtreyi seçin. Örneği odakla ve tam güçle aydınlat. Şimdi daha büyük bir aydınlatma alanı elde etmek için 5X objektif kullanın ve kaydırak ile objektif veya gövde arasında herhangi bir temas önlemek için aşamayı tamamen indirin.

Son olarak, her kuyudan çıkan lityum borohidrid çözeltisini cam bir Pasteur pipeti ile boşaltın ve orijinal ağartıcı çözelti bebeklerine geri getirin. Slaytları üç kez seyreltme tamponu ile yıkayın ve her yıkama sırasında yaklaşık üç dakika kuluçka yapın. Antikor karışımını ekleyin ve numuneyi daha önce gösterildiği gibi boyayın.

Tedavi edilmemiş burun polip dokusu boyamasında CD3, CD4 ve CD20 ile boyama, eozinofil açısından zengin bölgelerde yoğun spesifik olmayan granül floresans göstermiştir. Gerçek membran lokalize sinyal ise daha düşük yoğunlukta mevcuttu. %5 yağsız sütle ön tedavi, özgün olmayan floresansı tamamen engelleyemedi ve ayrıca AF 532 gibi florofor için sinyal yoğunluğunu azalttı.

Dab ön tedavi CD20, CD3 ve CD4'teki spesifik olmayan floresansı azalttı, ancak DAPI ve AF 532 dahil olmak üzere birden fazla kanalda gerçek sinyal yoğunluğunu da azalttı. Heparinle ön tedavi, CD3, CD4, CD20 ve DAPI için yüksek sinyal yoğunluğunu korurken spesifik olmayan bağlanmayı etkili şekilde engellemiştir. Heparin, spesifik olmayan sinyali konsantrasyona bağlı olarak engelledi ve 10 birimde tam bastırma sağlandı ve yüksek konsantrasyonlarda zararlı bir etki gözlemlenmedi.

Üç kanallı görüntüleme sistemi alım süresini kısalttı, ancak AF 594'ün PE kanalına sızması ve çoklu lazer uyarımları nedeniyle geliştirilmiş doku otofloresansı dahil çapraz konuşma getirdi. Spektral görüntüleme, neredeyse tüm arka plan ve çapraz konuşmayı ortadan kaldırırken, alım süresini azaltmış ve sinyal-arka oranını iyileştirmiştir. İnsan burun polipinin spektral IBEX görüntülemesi, EpCAM ile işaretlenmiş epitel yapılarını ortaya çıkardı.

CD3 pozitif ve CD20 pozitif lenfositler gibi bağışıklık hücreleri ile CD31 ve CD34 ifade eden damarlar. Heparin tedavisi, sinyali azaltmadan granül bağlanmasını ortadan kaldırdı ve IBEX döngüleri boyunca güçlü arka plan baskısını sürdürdü. Spektral karışıklama, sızmayı en aza indirir ve otofloresans ile arka plana sinyal artışı sağlar ve çoklu panel alımı çok kanallı konfokal ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde hızlandırır.

Bu, doğru hücre durumu haritalaması ve komşuluk düzeyinde analizi destekleyen sağlam mekansal proteomikler ve zorlu dokular sağlar.