Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)

Tek hücreli proteomikleri, translasyon sonrası modifikasyonlar için küresel kromatin heterojenliğini incelemek amacıyla otomatik çoklu bir yöntemle geliştiriyoruz. Bu protokolü zorlaştıran şey, pikogram ölçeği proteomik hazırlanması, çoklu etiketleme ve karmaşık kombinatoryal modifiye histon peptitlerinin çözümlenmesidir. Başlamak için, Hep G2/C3A hepatosellüler karsinom hücrelerini buz gibi soğuk PBS'de mikrolitre başına 200 ila 500 hücre konsantrasyonunda yeniden oluşturun.

Her nozulun darbe genişliğini ve sürücü voltajını üreticinin sağladığı değerlere ayarlayın. Maksimum manyetik verimliliği için, iki nozül arasındaki Z offset'in 50 mikrometreden daha az fark olduğundan emin olun. Her nozul için optimal temas konumunu belirleyin ve nozul kurulum sekmesinde Z yükseklik okumalarını karşılaştırın.

Tuplex çoklu yayın şeması için, bir sürgü kaputundaki sürgü tutucuya yükleyin ve ardından enstrümana aktarın. Pipet kullanarak, 150 mikrolitre LCMS sınıfı DMSO'yu yeni bir PCR tüpüne aldırın. Yıkama istasyonunun ikinci yerine koyun, boru kapağı alet kapısına bakacak şekilde yerleştirin.

DMSO koşusuna başla. DMSO aspirasyonundan sonra bir kez stabil drop elde edin. PDC şeffaflığındaki değişikliğe dikkat edin.

Voltajın artırılması gerekebilir. Düşüş ses kontrolü yaparak stabiliteyi doğrulayın. Kamerayı hizalamak için baş kamera sihirbazı kurulumunu yapın.

DMSO'yu dağıtın ve cihazın nomeleri otomatik olarak temizlemesine ve kalite kontrolü için tüm slaytlarda görüntü kaydetmesine izin verin. Bu görüntüleri inceleyerek her slaytta bir DMSO damlası olduğunu ve eksik ya da hedefin dışında damlacık olup olmadığını kontrol edin. Hücre askısını aspire ettikten sonra, hücreyi bir modülde açın, arka plan yakalaması yapın ve ardından fırlatma bölgesini tanımlamak için haritalama rutini çalıştırılır.

Analizi yapın ve ardından parçacıkları boyut ve uzamaya göre hücreler için kapı ile seçin. Şimdi, LCMS sınıfı suda taze bir sindirim master karışımı hazırlayın. Çözeltiyi vakum pompasıyla buz üzerinde 10 dakika gaz ile aşındırın.

Sindirim karışımını slaytlara dağıttıktan sonra, enstrümanın nomeleri otomatik olarak yıkamasına ve her slaytı fotoğraflamasına izin verin. Her damlanın sindirim karışımını eşit şekilde aldığından emin olmak için görüntüleri inceleyin. Sindirim için slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kuluçka edin.

Buharlaştırma ve gece boyunca sindirim başlattıktan sonra görüntüleri inceleyin. Damlalar yeterince kuruysa, koşu durdurun. Eğer yoksa, devam et'e tıklayıp beş dakika daha kurut.

Etiketleme için önce çoklu histon derifizasyonu için stok çözeltileri hazırlanın. Dağıtımdan sonra, cihazın nomeleri otomatik olarak yıkamasına ve her slaytı fotoğraflamasına izin verin. Görüntüleri gözden geçirerek tüm slaytlarda eşit dağılımını ve doğru damla yerleşimini doğrulayın.

İnkubasyon tamamlandıktan sonra, hidroksilamin çözeltisi söndürülmek için dağıtılır. Örneği almak için ana sekmeden koşuyu seçin ve ardından koşu sekmesinden çalıştırın. Manyetik işlem bittikten sonra, hata olup olmadığını kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.

Pickup işlemi bittikten sonra, manyetik plakanın kapağını çıkarın. Sonra örnekleri düşük ısıda vakum konsantratöründe kurutun. Veri toplama için yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemi programlanın.

MS iki deneyini 50 kütle aşırı yükü izolasyon pencereleri, %27 yüksek enerjili çarpışma ayrışması ve %1000 otomatik kazanç kontrol hedefi olacak şekilde ayarlayın. Plakayı kauçuk bir concap matı ile kaplayın ve otomatik sampler'ın içine yerleştirin. Ham dosyalar alındıktan sonra kısa bir süreliğine kromatogramı kontrol edin ve ardından ham veriyi EpiProfile sürüm 2.1'de çalıştırın. Normalize edilmiş histon PTM bolluklarının çıktı tablosunu inceleyin ve bunu aşağı akış analizleri için kullanın.

İlk 20 histon H3 peptidoformu, kontrol ve sodyum bütirat ile işlenmiş koşullarda göreceli bolluklarını göstererek nicelendirildi. Hem H3 K9 asetilasyonu hem de H3 K14 asetilasyonu, sodyum bütirat işlemiyle daha yüksek göreceli bolluk göstermiştir. H3 K9 asetilasyonu ise K14 asetilasyonu işlenmiş hücrelerde daha da zenginleşmiş görünüyordu.

Sodyum bütirat tedavisinden sonra toplam asetilasyon seviyeleri arttı; tedavi edilen hücreler, tek hücre seviyesinde yakalanan daha yüksek heterojenliği yansıtan kontrollere kıyasla daha geniş bir hata dağılımı gösterdi. Tek ve birlikte gerçekleşen histon modifikasyonlarının nicelendirilmesi, kombinatoryal asetilasyon durumlarının sodyum bütirat tarafından en güçlü şekilde etkilendiğini göstermiştir. Sodyum bütirat ile işlenmiş hücrelerin daha geniş dağılması, sferoidler içindeki bireysel hücreler arasında artan biyolojik heterojenliği göstermiştir.

Bu protokol, bilim insanlarının tek hücre çözeltisinde kromatin durumlarını incelemesine olanak tanıyarak epigenetik araştırmadaki boşluğu kapatır. Bu iş akışı, yüksek verimli örnek hazırlama, örnek çoklaması ve tarafsız kütle spektrometrisi ile hem hassas hem de nicel tek hücreli epigenetik veriler üretmeyi sağlar. Gelecekteki araştırmalar, kromatinin düzenlenmesinin kanser, metabolik hastalıklar ve yaşlanma gibi hastalık durumlarını nasıl değiştirdiğini keşfedecek.