Drosophila melanogaster için Xenon Anestezi ile Hiperbarik Basınç Sisteminin Doğrulanması

Araştırmalarım genel anestezinin nasıl çalıştığını anlamayı hedefliyor ve hiperbarik koşullarda anestezik olan birkaç gaz var. Bu protokol, meyve sineklerini ksenon ile anestezi altına almamıza ve genel anestezinin temel mekanizmasını incelememize olanak tanır. Başlamak için, her deney için bir ila üç gün yaşındaki 20 anestezi altındaki dişi ve erkek drosophila melanogaster sineği toplanın ve deneyden önce yaklaşık 22 derece Celsius sıcaklıkta yiyeceklerle birlikte bir şişede en az 24 saat dinlendirin.

Gaz tüpünlerinden çıkan gazları deneysel kullanım için sızdırmaz gaz torbalarına aktarın. Silikon boru kullanarak, gaz tüpünün çıkışını doğrudan gaz torbası girişine bağlayarak gaz transferini mümkün kılın. 25 milimetre uzunluğunda silikon bir boru polipropilen şırıngaya takın.

Polipropilen şırıngayı gaz torbalarına ve üç yollu musluğa bağlayın. Hiperbarik düzeni monte etmek için, önce LED ışık tablosunu masanın üzerinde yatay konumda konumlandırın. Enjeksiyon pompasını, LED ışık masasının kısa bir kenarına yakın konumlandırın; deneysel şırınga, yerleştirildiğinde arka ışığın üzerine uzanacak şekilde konumlandırın.

Şimdi, 75 milimetre uzunluğunda silikon bir tüp kesin. Üç yollu musluğu, merkezi nozuldan gelen silikon boru kullanarak manometreye bağlayın. Tüplerin sıkıca sabitlendiğinden emin olmak için manometre tarafındaki nozulda ve üst üstteki üç yollu muslukta ana yaylı kelepçeler kullanın.

Sonra, enjeksiyon pompası kontrol ünitesinde çift okla işaretlenmiş düğmeyi kullanarak hızı dakikada 80 milimetreye ve süreyi 38 saniyeye ayarlayarak pistonun otomatik sıkıştırılması veya dekompresyonunu elde edebilirsiniz. Sonra, deney odasındaki ortam ışığını sınırlandırın ve LED ışık masasını açın. Video kontrastını artırmak için parlaklık seviyesini üçe ayarlayın.

Polikarbonat şırıngadan pistonu çıkarın. Sinek kaçmasını önlemek için şırınganın ucuna az miktarda pamuk yerleştirin. 40 sinekleri polikarbonat şırıngaya aktarmak için şişe kapağını çıkarın, şırınga namlusunu şişenin üzerine yerleştirin, montajı ters çevirin ve sinekleri şırınga namlusuna taşımak için musluk kullanın.

Sineklerin en iyi görselleştirilmesi için şırtingi kameraya bakacak şekilde konumlandırın. Şırıngayı ayarlanabilir vidalarla hem namlu hem de piston başlığını enjeksiyon pompasına sabitleyerek sabitleyin. Şimdi, şırınganın ucundaki pamuku çıkarın ve şırıngayı üç yollu musluğa bağlayın.

Video kaydına başlayın. Manometreyi açın, sonra manometreyi şırıngaya bağlamak için durdurmayı çevirin ve kilopaskal basıncın sıfır olduğunu doğrulayın. Üç yönlü musluğu yanal konuma çevirerek şırıngayla hava alışverişi sağlanır.

Enjeksiyon pompasının manuel kontrol seçeneğini kullanarak, pistonu 20 mililitrelik işaretten iki mililitre işaretine taşıyın. Gaz torbasından polipropilen şırıngaya 18 mililitre anestezik gaz avizesi verin. Şırıngayı, üç yollu musluğun yan yem kilidi portuna bağlayın.

Sonra, enjeksiyon pompasının manuel seçeneğini kullanarak pistonu 20 mililitre noktasına geri getirin. Manometreyi şırıngaya bağlamak için stopu çevirin ve basınç ölçümünü izleyin. Önceden ayarlanmış hız ve süre ayarlarıyla otomatik piston hareketini başlatın.

Basıncı izlerken pistonun beş mililitre seviyesine 38 saniye içinde ulaşmasına izin verin. Pistonu beş mililitre pozisyonda 20 saniye boyunca bırakın ve tepe basıncı not edin. Şırıngaya hafifçe dokunarak pistona yapışan sinekleri çıkarın ve onların altına yerleşmesini sağlayın.

20 saniye sonra otomatik dekompresyonu başlatın. Piston 20 mililitre döndüğünde deneyi sonlandırın ve kaçak kontrolü için son basıncı kaydedin. Videoları düzenlemek için ScreenFlow'u başlatın.

Her kaydedilmiş videoyu enjektör namlusunun ilk beş mililitresine karşılık gelen ilgi alanına kırpın. Her videoyu şırınga dekompresyonundan sonraki ilk 20 saniyeye kadar kısaltın. Videoları GIF olarak dışa aktarın ve çoğaltın.

Şimdi, farklı kopyalardan ilk ve son kareleri kaldırmak için Fiji yazılımını başlatın. Sıralıca, görüntü, video düzenleme üzerine tıklayın ve kareleri silin. Proses, ikili ve her GIF dosyasını ikili hale getir, böylece sinekler siyah bir arka plan üzerinde beyaz görünsün.

Fiji'de her iki ikili dosyayı da açın. Piksel farkı dosyası oluşturmak için süreç ve görüntü hesaplayıcısını seçerek aralarındaki piksel farkını hesaplayın. Piksel farkı dosyasını kaydettikten sonra, parçacıkları analiz ve analiz et, piksel boyutu eşiklerini ayarlayarak sinyal-gürültü oranını iyileştirin.

Kare başına piksel farklarını içeren oluşturulan CSV dosyasını kaydet. Verileri kullanarak kareler arasında kümülatif hareketi hesaplayarak istatistiksel karşılaştırma yapın. Deneysel videolar, piksel analizine hazırlanmak için ikili ve fark görüntülerine dönüştürülerek işlendi.

Eşik belirleme olmadan, piksel farkları kareler boyunca birikmiş ve temel sinyal yaklaşık 20.000'e yükselmiştir. 100'den 1000'e kadar piksel boyutu eşiği uygulandığında, arka plan sinyalini azalttı ve sinek hareketinden kaynaklanan farkları vurguladı. Kare başına piksel farkı değerleri, 200. kare öncesinde sıfıra yakındı.

YOLOv11 N modeli, sinekleri yüksek kare başına doğrulukla takip ediyordu, ancak sık sık tıkanmalar aşırı sinek kimliği atamalarına yol açıyordu. İzleme tutarsızlıkları nedeniyle, sinek hareketleri tüm deneme başına toplanarak ve maksimum 200 ID ile normalleştirilerek nicele edildi. %85 ksenona maruz kalan sinekler, %90 veya %95 ksenona maruz kalanlara göre daha hızlı toparlandı ve daha fazla hareket etti.

Protokolümüz sadelik ve hız sunuyor ve geleneksel basınç odalarından daha ucuz malzemeler kullanıyor. Maksimum basınç yaklaşık dört atmosferle sınırlıdır ve kusursuz sızdırmazlık kademeli basınç kaybına yol açar. Bu kurulum, küçük model organizmalarda anestezik gazın davranış üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir ölçümlerini mümkün kılar.