Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Araştırmalarım T hücrelerinin zarına odaklanmakta ve terapötik hedefleme ile ilgili yeni nano ölçekli içgörülerin ortaya çıkmasını amaçlıyor. Mevcut görüntüleme yöntemleri genellikle hücrelerdeki nano ölçekli antikor-epitop etkileşimlerini doğrudan görselleştirmez. Bu protokol, hücresel ortamda doğrudan gözlem yapılmasını sağlayarak bu sınırlamayı aşmaktadır.

Örneği mikroskopa monte edip yüzeye altın kolloidler yerleştirdikten sonra, ilgi alanına yeterince kolloidin biriktirildiğini doğrulamak için parlak alan aydınlatması kullanın. Devam etmeden önce, ilgilenildiği bölgede ideal 5 ila 10 altın kolloidinin bulunduğunu doğrulayın. Antikor probu floroforun optik konfigürasyonu için görüntüleme yazılımını açın ve optik yapılandırma ayarlarına erişin.

Uygun dikroik aynayı seçin ve lazer uyarılma dalga boyu ile güç yoğunluğunu ayarlayın. Kamera entegrasyon süresini ayarlayın ve emisyon filtresini seçin. Sonra, kameranın piksel binningini 150 ila 160 nanometre arasında piksel boyutuna ayarlayın.

Şimdi, görüntüleme yazılımında bir fotoğraf ağartma modu seçerek fotoğraf ağartma adımı için optik bir yapılandırma oluşturun. Lazer gücünü %100'e ayarlayın ve kamera entegrasyon süresini bir saniyeye ayarlayın. Görüntü alma yazılımında görüntü alma parametrelerini, aydınlatma dışı aralık, kare sayısı ve fotoğraf ağartma adımının frekansını belirleyerek ayarlayın.

Sonra, görüntüleme tamponunu DPBS'de üretilen %5 BSA içinde CD81 antikorunu mililitrede 1 mikrogram konsantrasyona seyreltirerek hazırlayın. Önerilen nihai antikor konsantrasyonu Jurkat T hücreleri için 0,5 nanomolar veya U-2 OS hücreleri için 2 nanomolardır. Hazırlanmış görüntüleme tamponunu hücrelerin bulunduğu kuyuya ekleyin ve yazılımda görüntü alımını başlatarak veri toplamaya başlayın.

Gerçek zamanlı olarak antikor bağlanmasını izlemek için membran tek antikor etiketlemesi için yapılandırılmış görüntüleme yazılımındaki canlı görüntü fonksiyonunu kullanın. Görüntü alma yazılımında görüntüleme parametrelerini en az 10 kare çekim elde edecek şekilde yapılandırın ve aydınlatma olmayan aralığı beş saniyeye ayarlayın. Alıma başlayın ve kaydedilen filmde tek molekül lokalizasyonlarının seyrekliğini değerlendirin.

Görüntüleme tamponu eklendikten hemen sonra birden fazla örtüşen antikor bağlanma olayı gözlemlenirse veya tek molekül lokalizasyonları zamanla biriktirilirse, alım iptal edilir. Antikor konsantrasyonunu iki kat azaltın ve yeni bir örnekte alımı tekrarlayın. Antikor konsantrasyonunu iki kat azaltmaya devam edin ve istenen tek molekül lokalizasyon yoğunluğuna ulaşana kadar birim alan başına olay sayısını yeniden değerlendirin.

Olay yoğunluğu seyrekse, görüntüleme tamponundaki antikor konsantrasyonunu iki kat artırın. Yeni bir örnekte alımı tekrarlayın ve antikor konsantrasyonunu iki kat artırmaya devam edin; böylece istenen tek molekül lokalizasyon yoğunluğu elde edilene kadar birim alan başına bağlanma olaylarının sayısını yeniden değerlendirin. Aydınlatma dışı aralık optimizasyonu için, görüntü alma yazılımında görüntüleme parametrelerini yapılandırarak 50 kare bir yakalama elde edin.

Antikor eklendikten ve alınmaya başladıktan sonra, kaydedilen filmde tek moleküllü lokalizasyonların yoğunluğunu ve seyrekliğini değerlendirin. Optimum tek moleküllü olay yoğunluğunu sağlayan en düşük aydınlatma olmayan aralığı belirleyin. Son olarak, görüntü alımı ilerledikçe mekansal olarak örtüşen bağlanma olayları meydana gelirse, düzenli aralıklarla bir foto ağartma adımı uygulanır.

Fotoğraf ağartma frekansını, bağlanmış antikorlardan gelen floresansın örtüşme olayları birikmeden önce çıkarması için ayarlayın. MATLAB yazılımında dosya yolunu, yeniden oluşturulmuş M hücresi virgüllü ayrılmış değerler dosyasını içeren klasöre ayarlayın. Kodu çalıştırmak için MATLAB araç çubuğunda Çalıştır tuşuna tıklayın.

Istendiğinde, M hücreli CSV dosyasını seçin ve programa yüklemek için Aç tuşuna tıklayın. Analizi, daha önce tanımlanmış girdiler kullanılarak başlangıç noktası olarak çalıştırın. Kümelenmemiş yerelleştirme verilerini içeren dağılma grafiğinin değerlendirilmesi.

Hücredeki gürültü lokalizasyonlarından daha yüksek ama daha düşük bir puan değeri seçin. Kümelenmiş verileri gösteren pencereyi değerlendirin. Hücrede beklenen fenotipe sahip kümelerin korunduğunu, hücre dışındaki lokalizasyonların ise en aza indirildiğini doğrulayın.

Kümeleme parametreleri çok kısıtlayıcıysa, minimum puan değerini azaltıp epsilon artırın. Kümeleme parametreleri çok kapsayıcıysa, minimum puan değerini artırıp epsilonu azaltın. Son olarak, minimum puan değeri ve epsilon ayarlandıktan sonra, optimal kümeleme elde etmek için kodu tekrar çalıştırın.

Jurkat T hücreleri, zar bütünlüğünü korumak ve antikor membran epitoplarına erişimini sağlamak için yeterli aralıkla immobilize edildi. Altın kolloidler görselleştirilmiş ve M hücresi görüntü alımı sırasında lateral kayma düzeltmesi için fiducial belirteç olarak kullanılmıştır. Aydınlatma dışı aralığın optimizasyonu, beş saniyelik bir aralığın, bir nanomolar antikor konsantrasyonundaki kısa veya uzun aralıklara kıyasla minimum uzamsal örtüşmeyle antikor bağlanma olayları ürettiğini gösterdi.

Kayma düzeltme uygulaması, düzeltilmemiş yeniden yapılandırmaya kıyasla yeniden oluşturulan M hücresi görüntüsünü geliştirmiştir. M hücre lokalizasyonlarının yoğunluk tabanlı kümelenmesi, düşük yoğunluklu arka plan etkileşimlerini azalttı ve kümelenmiş CD81 bağlanma olaylarını vurguladı. Antikorların membran epitoplarıyla hücresel ortamda etkileşimini gözlemleyebilir ve bu da terapötik antikorlarla ilgili içgörüler sağlar.

Antikor konsantrasyonu, aydınlatma dışı aralık ve foto ağartma adımları optimize etmek için kritiktir. Optimal olmayan parametreler sonuçları tehlikeye atacaktır. Tek antikor etiketleme, aynı hücre ortamında birden fazla antikor tarafından membran protein bağlanmasını aynı anda değerlendirecek şekilde genişletilebilir.