Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere

Herkese merhaba. Bu videoda, veri edinimi ve yüklemeden temel keşfe ve nihayetinde ileri analize kadar uzanan pratik bir uzamsal transkriptomik veri analizi hattını inceleyeceğiz. Genel olarak iş akışı üç ana adımdan oluşmaktadır.

İlk olarak verilerin indirilmesi, ikinci olarak analiz kodunun temin edilmesi ve üçüncü olarak sonuçları oluşturmak için iş akışının çalıştırılması. Birinci adım, veri edinimi ve dizin yapısının hazırlanması. İlk olarak, halka açık konumsal transkriptomik veri setlerini temin edin.

Ham veri arşivini indirin. Ardından arşivi dışa aktarın. Dosyaları standartlaştırılmış bir dizin yapısında düzenleyin.

Öncelikle ana bir veri dizini oluşturun ve ardından her örnek için özel bir alt dizin oluşturun. Her örnek için gerekli olan aşağıdaki temel dosyaları ilgili alt dizine aktarın. Son olarak, her örnek dizini içinde bir spatial alt klasörü oluşturun.

Aşağıdaki dosyaları spatial alt klasörüne yerleştirin. Filtrelenmiş özellik PC metrikleri S1 dosyasını örneğin ana alt dizinine yerleştirin. Spatial klasöründeki gzip dosyalarınıle basınçtan çıkarın.

Orijinal dosya adlarının load 10X spatial fonksiyonunun gereksinimlerine uygun şekilde kaldığından emin olun. İkinci adım, yazılım ortamının kurulumudur. Burada R dilinin kurulumu atlanmıştır ve veri işleme süreci, GitHub deposundaki analiz betiğinin alınmasıyla başlar.

Dosya iletkenindeki Graham'dan gerekli R paketlerini setup R betiğini çalıştırarak yükleyin. Resmi belge sayfasında verilen kurulum komutlarını çalıştırarak auto suit'i kurun. Kurulum betiklerini almak için resmi kurulum URL'sine gidin. Kurulum sayfası talimatlarına göre gerekli Python ortamını ve sistem bağımlılıklarını başlatın.

GitHub deposuna giderek özel aracı edinin ve kaynak kodunu indirin. TOS dizinine gidin ve Python bağımlılıklarını yükleyin. Üçüncü adım, mekansal veri yükleme ve kalite kontrolüdür.

Uzamsal verileri Seurat nesnesine aktarın. Yüksek çözünürlüklü doku görüntüsünü manuel olarak yüklemek için read 10X image fonksiyonunu kullanın. Burada görüntüyü ve görüntü adını belirtin.

Görüntü parametresi önceki adımda oluşturulan görüntü nesnesine ayarlanmış şekilde load 10X spatial fonksiyonunu kullanın ve Seurat nesnesini oluşturun. Kalite kontrol metriklerini hesaplayın. mt. deseniyle tanımlanan percentage feature set kullanarak mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın.

Verileri QC metriklerine dayanarak görselleştirin ve yorumlayın. Violin plot fonksiyonunu kullanarak nCount_Spatial, nFeature_Spatial ve percent.mt için keman grafikleri oluşturun.

Bu metriklerin mekansal özellik grafiklerini oluşturmak için mekansal özellik grafiklerini kullanın. Ve doku alanının dışındaki spotları belirleyin. İsteğe bağlı olarak, düşük kaliteli spotları çıkarmak için filtreler uygulayın.

Betik çalıştırıldıktan sonra, QC metrikleri ve özellik uzamsal grafiği dahil olmak üzere bu sonuçları elde edebilirsiniz. Dördüncü adım; veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme. Bireysel örneklerin ön işlemesinde normalizasyon yapın.

Spatial analizi ile her bir örneğe ayrı ayrı SC transform normalizasyonu uygulayın. Birden fazla örneği entegre edin. Entegrasyon için SCTransform ile normalize edilmiş nesnelerin listesini hazırlayın.

Uzamsal analizi kopyalayarak her nesnenin bir RNA analizi olduğundan emin olun. Paylaşılan değişken özellikleri belirlemek için PREP SCT entegrasyonundaki seçilmiş entegrasyon özelliklerini kullanın. Normalizasyon yöntemi SCT olan find integration anchors ile entegrasyon çapalarını bulun.

Verileri IntegrateData kullanarak entegre edin. Entegre edilmiş analiz üzerinde kümeleme için boyut indirgeme işlemini gerçekleştirin. runPCA kullanarak entegre edilmiş veriler üzerinde PCA çalıştırın.

Kümülatif açıklanan varyansı hesaplayarak, sonraki analizler için optimal temel bileşen sayısını belirleyin. Dirsek noktasını program aracılığıyla tespit edin. Belirlenen temel bileşen (PC) sayısını kullanarak UMap çalıştırın.

FindNeighbors ve FindClusters kullanarak hücreleri kümeleyin. Belirlenen PC'leri 0,5 çözünürlük ayarıyla belirtin. FindWorkers fonksiyonunu kullanarak hedef gruplar arasında diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirin.

Uzamsal olarak değişken genleri belirleyin. Her bir orijinal örnek için, uzamsal otokorelasyonu hesaplamak amacıyla SCT testi üzerinde Moran's I yöntemini kullanarak uzamsal olarak değişken özellikler belirleme işlemini (find spatially variable features) çalıştırın. Bu betiği çalıştırdıktan sonra; dirsek grafiğini (elbow plot), UMap grafiğini, küme grafiğini, küme belirteçleri ısı haritasını, yanardağ grafiğini (volcano plot), uzamsal özellik olarak farklı ifade edilen genleri, uzamsal olarak güvenilir genleri ve kolon tabakası belirteçlerini elde edebilirsiniz.

Kolon tabakası belirteçlerinin nokta grafiği ve mekansal özellik grafiğindeki belirteçler. Beşinci adım, tek hücre referans veri ön işlemesi. read 10X kullanarak tek hücre RNA-seq sayım matrisini okuyun ve bir Seurat nesnesi oluşturun.

Standart QC normalizasyonu ve küme ayıklama (declustering) işlemlerini gerçekleştirin. Filtrelenen hücrelerdeki mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın. Verileri SC transform kullanarak normalize edin.

Bir vara.to. belirleyin, percent.mt değerini regrese edin. Long PCA UMap uygulayın ve hücreleri önceki adımlarda açıklanan dinamik PC seçim yöntemini kullanarak kümeleyin, ardından hücre tiplerini açıklayın.

AddModuleScore kullanarak kanonik hücre tipi belirteç genleri için modül skorlarını hesaplayın. Kümeleri, modül skorlarına ve bilinen biyolojik verilere göre tanımlayın. Alternatif olarak, önceden hesaplanmış tanımlamaları metadata üzerinden içe aktarın.

Bu betiği öğrendikten sonra, QC metriklerini elde edebilirsiniz. Kümelere göre UMap, örneklere göre UMap ve hücre tipi skorlarını yüklemişlerdir. Altıncı adım, SPOTlight ile referans kılavuzlu dekonvolüsyon işlemidir.

İlk olarak, SPOTlight için verileri hazırlayın. Açıklamalı tek hücreli Seurat nesnesini ve mekansal Seurat nesnesini tek hücreli deney nesnesine dönüştürün. Tek hücreli verileri LogMoreCounts kullanarak log-normalize edin.

Ardından SPOTlight dekonvolüsyonunu çalıştırın. İlk olarak, ModelGeneVar kullanarak tek hücreli veriler üzerindeki yüksek değişkenli genleri belirleyin. Skor belirteçlerini kullanarak hücre tipi belirteçlerini hesaplayın ve yüksek kaliteli belirteçler için filtreleme yapın.

Hesaplama süresini azaltmak için her hücre tipi için tek hücre referansını yönetilebilir bir sayıya düşürün. Tek hücre referansını, mekansal verileri, işaretleyici listesini ve HVG'leri sağlayarak SPOTlight fonksiyonu ile dekonvolüsyonu gerçekleştirin; ardından sonuçları görselleştirebilir ve dışa aktarabiliriz. Dekonvolüsyon sonucunu, bir scatter pipe route olarak gösterilen şu şekilde elde edebilirsiniz.

Yedinci adım, Stdeconvolve ile denetimsiz dekonvolüsyon. Öncelikle uzamsal verileri hazırlayın. Uzamsal Seurat nesnesinden, counts slot'u ile GetAssayData kullanarak satır sayısı metriklerini çıkarın.

STdeconvolve'dan elde edilen temiz sayımlar kullanılarak düşük kaliteli spotlar ve genler temizlenir. Corpus, fitLDA kullanılarak bir dizi potansiyel konu sayısı üzerinden tahsis modeline ulaşan restrict strict LDA ile spotların minimum bir fraksiyonunda ifade edilen dört geni kullanarak filtreler için gizli hücre tiplerini tanımlar. opt min ile optimal model kullanılarak minimum karmaşıklığa dayalı olarak en uygun model seçilir.

Sonuçları analiz edin ve görselleştirin. Optimal model için serotip oranını (Theta) ve gen profillerini (Beta) getBetaTheta kullanarak çıkarın. Korozyon konularının biyolojik yorumunu eklemek için, seçili mekansal nokta (select spatial spot) aracıyla oluşturulan ilgi alanı anotasyonlarını içe aktarın.

Bu notasyonları "all topics" fonksiyonunda grubun parametresi olarak kullanın. Dekonvolüye edilmiş hücre tipi oranlarını projenizin uzamsal koordinatlarına geri aktarın ve spotları ROI'lerine göre renk kodlayın. Betiği çalıştırdıktan sonra, SPOTlight tarafından üretilenlere benzer şekilde, bir ölçek boru yüklemesi gibi şu sonucu elde edeceksiniz.

Sekizinci adım, Giotto kullanılarak gerçekleştirilen mekansal hücre-hücre iletişimi. Öncelikle, Seurat nesnesini bir Giotto nesnesine dönüştürün. Düşük sayım metriklerini ve mekansal koordinatları sağlayarak createGiottoObject fonksiyonunu kullanın.

Giotto nesnesini ön işlemeden geçirin ve dekonvolüsyon sonucunu ekleyin. Verileri normalize edilmiş Giotto kullanarak normalize edin ve serotip anotasyonları olarak ekleyin. addCellmetadata kullanarak hücre meta verilerini seçin.

createSpatialNetwork kullanarak mekansal ağ oluşturun. Ortamımıza bir ligand reseptör veri tabanı yükleyin. Hücre tipleri arasındaki mekansal yakınlıkta bulunan anlamlı ligand reseptör etkileşimlerini belirlemek için explore CellCellcom komutunu çalıştırın.

Hücre-hücre etkileşimi nokta grafiğini bu şekilde elde edebilirsiniz. Dokuzuncu adım isteğe bağlıdır. SelectSpatialSpot ile etkileşimli nokta seçimi.

six betiğini kullanarak etkileşimli araç için verileri hazırlayın. GetTissueCoordinates kullanarak Seurat nesnesinden uzamsal koordinatları çıkarın. Verileri biçimlendirin ve dışa aktarın.

Oluşturulan veri çerçevesini bir CSV dosyasına aktarın. Ardından ilgi alanı analizi gerçekleştirin. Özel uygulamayı başlatın.

Spatial spots dash uygulamalarını seçin ve CSV dosyasını yükleyin. Konumsal konuma göre noktaları etkileşimli olarak seçin. Ardından, seçilen noktaların listesini ve atanan gruplarını yeni bir CSV dosyası olarak dışa aktarın.

Betiği sırasıyla çalıştırdıktan sonra neler elde edebileceğimizi kontrol ediyoruz. Tüm sonuçlar "results five-fold" klasörüne kaydedilir. Gördüğünüz üzere, QC metriklerini elde edebilir ve bunları bölebiliriz.

Mekansal özellik grafiğini buradan kontrol edebilirsiniz. Ayrıca, dekonvolüsyon işlemi hem denetimli hem de denetimsiz yöntemlerle gerçekleştirilmiştir. SPOTlight sonuçları burada yer almaktadır.

Gördüğünüz gibi, tüm noktalar oran bilgilerini içermektedir. STdeconvolve ile elde edilen gözetimsiz dekonvolüsyon sonuçları da burada oluşturulmuştur. Bu ise mekânsal verideki noktanın Seurat kümeleme sonucudur.

Bunları, şu şekilde, mekansal ekip grafiğinde de görselleştirebilirsiniz. Dahası, Giotto ile nokta-nokta etkileşimi sonucunu da elde edebilirsiniz. Bu iş akışının tamamı %100 açık kaynaktır.

Ekspresyon metriklerinden gelişmiş uzamsal modellemeye kadar noktalama analizi. Tüm adımlar 16GB RAM'e sahip bir makinede çalıştırılmaktadır. Kod tabanı modülerdir; her görev için bir betik bulunmaktadır.

Bu iş akışının, FASTQ dosyalarından başlayan ön işleme aşamalarını kapsamadığını unutmayın. Odak noktası 2D mekânsal verilerdir ve şu an için yalnızca Visium'un indiricilerini içermektedir. Hepsi bu kadar, izlediğiniz için teşekkürler.