İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitokondriler, metabolizma ve enerji üretiminden programlı hücre ölümüne ve steroid hormon sentezine kadar hücre fizyolojisinde çok sayıda role sahiptir. Mitokondrilerin hem temel hücresel fonksiyonlardaki hem de hastalıklardaki önemine rağmen, insan embriyonik kök hücrelerinde ve bunların farklılaşmış soyundan gelen hücrelerdeki fonksiyonları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu videoda, insan amry kök hücrelerinin mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin tekil aktivite analizleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini göstereceğiz.

Merhaba, ben University of California Los Angeles, Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Michael Tetel laboratuvarından Ivan OV. Bugün sizlere insan embriyonik kök hücrelerinde mitokondriyal solunum kompleksi fonksiyonlarının değerlendirilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Bu jel içi aktivite değerlendirme prosedürü; insan embriyonik kök hücrelerinden kaba mitokondriyal pellet izolasyonunu, oksidatif fosforilasyon sisteminin mitokondriyal komplekslerinin yüksek çözünürlüklü berrak doğal poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılmasını ve ardından gelen jel içi aktivite analizini içermektedir.

Hadi başlayalım. Bu prosedürdeki ilk adım, insan embriyonik kök hücrelerinden mitokondri izole etmektir. Bu analiz için, besleyici hücre içermeyen koşullarda matrijel kaplı bir plakta büyütülmüş insan embriyonik kök hücrelerini kullanacağız.

İnsan amry kök hücrelerimizden mitokondri toplamak için, öncelikle hücreleri ılık 1X PBS pH 7.4 ile yıkayarak başlarız ve ardından hücreleri beş dakika boyunca tripsinizle işleme tabi tutarız. Altı kuyucuklu bir plakada her kuyucuk için 1 ml 1X tripsin kullanabilirsiniz. Beş dakika sonra, 1X PBS içinde 1 mg/ml konsantrasyonunda eşit hacimde taze tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurabilir ve hücreleri hasat edebilirsiniz.

Toplanan hücreler daha sonra oda sıcaklığında, 200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Döndürme işleminden sonra, süpernatant atılır ve çökelmiş hücreler, taze hazırlanmış 1x proteaz inhibitörü kokteyli içeren 0,8 ila 1,7 mililitre buz soğukluğunda mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden süspande edilir. Kullanılacak tampon miktarı, elde edilen hücre pelletinin boyutuna bağlıdır. Pellet yeniden süspande edildikten sonra, yaklaşık 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.

İnkübasyonu takiben, hücreleri bir homojenizatör ile parçalıyoruz; bu işlem yaklaşık 40 ila 50 darbe sürebilir. Homojenizasyonun tamamlandığını, DOD hücrelerinden bir alikotu tripan mavisi ile boyayıp ışık mikroskobunda inceleyerek kontrol edebiliriz. Görüntü şuna benzer olmalıdır.

Bu, downs ile 50 darbeden sonraki ilk çekimdir. Bu, downs ile 80 darbeden sonraki ikinci çekimdir. Hücreler homojenize edildikten sonra, onları 4 °C'de 10 dakika boyunca 20,000 ×g'de santrifüjleyin. Bu işlem, çekirdekleri ve daha büyük hücre fragmanlarını da içeren kaba bir mitokondriyal pelet sağlayacaktır.

Pellet toplanmadan önce, sonraki pellet ağırlığını tahmin edebilmek için toplama tüpünü tartmalı, süpernatantı döküp atmalı ve ardından çökelmiş ham mitokondriyal pelleti tartmalıyız. Bu aşamada tüpün ağırlığını çıkararak, bir sonraki adımda gösterilecek olan pelleti çözücüde çözme işlemine geçilebilir. Ham mitokondriyal pelleti çözmek için, pellet buz üzerinde tutularak 35 µL buz gibi soğuk çözündürme tamponu ile vorteksleyerek işleme başlarız.

Detaylı bilgisine sahip olduğumuz her 20 miligram pelet için tampon bileşimleri beraberindeki yazılı protokolde belirtilmiştir. Vorteksleme ve solubilizasyon tamponu eklemesinin ardından, digitonin eklemeden önce, resüspande edilen peleti yüksek hızlı santrifüj için uygun bir tüpe aktarıyoruz ve ardından 20 miligram pelet ağırlığı için 20 mikrolitre %10 ağırlık/hacim digitonin ekleyip tüpü hafifçe sallayarak karıştırıyoruz; iyice karıştırıldıktan sonra mitokondriyal peleti buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe ediyoruz. Proteinleri solubilize etmek için digitonin yerine dodecyl beta-D-maltoside (DDM) veya Triton X 100 kullanılabilir.

Deterjan seçimi ve miktarı, buz üzerinde inkübasyon sonrası mitokondriyal komplekslerin supra kompleks veya multimerik formlarının oluşumunu etkileyebilir. Pelet solubilize edildikten sonra, örneği 4 °C'de 15 dakika boyunca 100.000 ×g hızda santrifüj edeceğiz ve ardından berrak süpernatantı toplayacağız. Artık süpernatantı, mitokondrilerin doğal gradyan jel elektroforezi için gradyan jelde yürütmeye hazırlayabiliriz.

%5 ile %13 arasında akrilamid gradyan jel ve %3,5'lik bir istifleme (stacking) jeli kullanılmasını öneririz. Jeli hazırlamak için, yazılı protokolde belirtilen akrilamid bis-akrilamid karışımını kullanacağız. Akrilamid bis-akrilamid çözeltisi önceden hazırlanır ve karanlık bir yerde, 4 °C'de saklanır.

Akrilamid ve bis akrilamid hem toz hem de sıvı formda toksik kimyasallardır, bu nedenle bunlarla çalışırken özel dikkat gösterilmelidir. Akrilamid bis akrilamid çözeltisini, 1.5 molar 6-aminoheksanoik asit ve pH 7.0'da 75 millimolar OLET içeren üç katı jel tamponu bir alikotu ile birleştiriyoruz. Tampona eklediğimiz akrilamid bis akrilamid çözeltisinin miktarı, gradyan jel oluşturmak için hazırladığımız jelin yüzde değerine bağlı olacaktır.

Bir adet %4'lük karışım ve bir adet %13'lük karışım hazırlayacağız, istifleme jeli ise %3,5'lik karışım olacaktır. %13'lük karışıma gliserol eklemeyi unutmayın. Üç karışım da hazır olduğunda, karışımlara uygun miktarda amonyum persülfat ve temed ekleyip karışımları gradyan oluşturucu döküm odasına döküyoruz.

Hücrenin sol kısmı %5'lik karışımı içerir. Hücrenin sağ kısmı, küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ile birlikte %13'lük karışımı içerir. Hücrenin sağ kısmını açarak jeli dökmeye başlarız.

Ardından hemen hücrenin sol kısmını açarız ve gradyanı oluşturmak için %5'lik çözeltinin %13'lük çözelti ile karışmasını sağlarız. Polimerizasyondan sonra jel için düzgün ve keskin bir sınır oluşturmak amacıyla jelin üst kısmına az miktarda izopropanol ekleriz. Yaklaşık bir saat sonra, gradyan jelin polimerizasyonu tamamlandığında, izopropanolü uzaklaştırırız ve 3,5 yığınlama jelini cihaza döküp bir jel tarağı yerleştiririz.

Jelleri yaklaşık dört ila yedi santigrat derece sıcaklıktaki bir soğuk odada hazırlayıp çalıştıracağız. Bu jeli çalıştırmak için iki farklı tampon kullanacağız. Anot odasında, 25 milimolar ole hidroklorik asit pH 7.0 içeren bir tampon kullanacağız.

Katot tamponu 50 milimolar tric, 7,5 milimolar hidroklorik asit, ağırlık/hacimce %0,02 doil beta D multiside veya DDM ve ağırlık/hacimce %0,05 dokozolat pH 7,0 içerecektir. Az önce döktüğümüz jelde yürütülecek olan süpernatantı hazırlamak için, ağırlık/hacimce %5 gliserol ve ağırlık/hacimce %0,01 Ponto S nihai konsantrasyonu sağlayacak şekilde yükleme tamponu eklenir; genellikle gliserol ve poncho s içeren 10x'lik bir stok çözelti süpernatantlara doğrudan eklenir.

Şimdi jel örneğini jele yüklemeye hazırız. Jel kuyucuklarını, her şerit için 20 ila 40 miligram ham mitokondriyal protein içeren bir hacimle dolduracağız. Yükleme işleminin hemen ardından jel 100 volt üzerinden yürütülür.

Numune istifleme jeline girdikten sonra, voltaj 15 miliamper akım sınırı ile 500 volta yükseltilebilir. Genellikle jeli gece boyunca 70 ile 100 volt arasında çalıştırsak da, kırmızı zos boyasının keskin bir hattı jel ön yüzüne yaklaştığında elektroforezi durdururuz. Jel çalıştırıldıktan sonra, farklı protein komplekslerinin aktivitesini doğrudan jel üzerinde analiz edebiliriz.

Her bir analiz için inkübasyon süresi, protein çözünürleştirme verimliliğine ve kuyu başına yüklenen materyal miktarına bağlıdır. Birinci, dördüncü ve beşinci kompleksler genellikle ikinci ve üçüncü komplekslerden daha güçlü sinyaller verir. Bu nedenle, ikinci ve üçüncü kompleksler için boyama süresi daha uzun tutulmalıdır.

Kompleks aktivitesini test etmek için, her kompleks için spesifik tamponlar kullanmamız gerekecektir. Münferit tamponların içeriklerini yazılı protokolde bulabilirsiniz. Şimdi, Ingel aktivite analizlerini ayrı ayrı gerçekleştirmek için jelden münferit şeritleri keseceğiz.

Beşinci kompleks hariç tüm kompleksler için, jel dilimini ilgili tampon çözeltilerde oda sıcaklığında birkaç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, jeli %50 methanol ve %10 acetic acid içerisinde 15 ila 45 dakika boyunca sabitleyin. Sabitlenen jel, %10 acetic acid içerisinde saklanır.

Burada kompleks 1 boyamasının nasıl göründüğünü görebilirsiniz. Jel diliminde kompleks 1'e karşılık gelen tek bir koyu mor bant bulunmaktadır. Şeffaf jeller, mitokondriyal kompleks aktivitelerinden densitometre yapmanıza ve karşılaştırmalı analizler gerçekleştirmenize olanak tanır.

Yoğun sitometri sonrası, uzun süreli saklama ve/veya yüksek kaliteli bir görüntü kompleksi elde etmek için tarama amacıyla jel dilimlerini genellikle kuruturuz; iki boyama, kompleks iki ile aynı mor renge sahipken kompleks üç ve kompleks dört turuncu veya sarımsı bir boyama bandı verir. Burada kompleks iki, üç ve dört boyama aktivitelerine örnekler yer almaktadır.

İnsan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen ve doğal jel elektroforezi dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü yöntemlerle ayrıştırılan mitokondriyal eksudatif aktivite komplekslerinin aktivitesinin nasıl analiz edileceğini size göstermiş olduk. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.