Nötrofil İzolasyon Protokolü
23 Temmuz 2008
Nötrofiller inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasında olup, görevlerini ve mekanizmalar in vitro yoğun çalışmalar yapılmıştır. Biz piyasada bulunan ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir.
Nötrofil izolasyon protokolü. Bu prosedür, tam kan örneğinden beyaz kan hücrelerini ekstrakte etmek için santrifüj ve tüpler kullanır. Vortex karıştırıcı, iğne ve şırınga, şırınga filtresi.
Millipore marka MX gv 0,22 Mikrometre materyalleri. Hank dengeli tuz çözeltisi ile nötrofil ayrıştırma işlemi iki çeşit HBSS çözeltisi gerektirir. Kalsiyum klorür içeren HBSS, insan serum albüminli bir çözelti hazırlamak için kullanılacaktır.
Nötrofilleri süspanse etmek ve yıkamak için kalsiyum klorür içermeyen HBSS kullanılacaktır. Lütfen bu prosedürde uygun HBSS solüsyonunu kullandığınızdan emin olun. İnsan serum albümini veya HSA, kan plazmasında pH'ı ve SMO basıncını koruyan bir proteindir.
Sığır serumu amalgamat kırmızı hücre lizis tamponu kullanmayın. Bu ürün Roche Diagnostics tarafından üretilmiştir; nötrofil izolasyon medyumu NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly ayırma medyumu ışığa karşı korunmalı ve en iyi sonuçlar için buzdolabında saklanmalıdır. Tüm reaktifler kullanım sırasında oda sıcaklığında olmalıdır.
Reaktifleri deneyden bir saat önce buzdolabından çıkarın. Nötrofil ayrıştırma işlemi için HBSS-HSA çözeltisini hazırlayın. Kalsiyum klorür içeren HBSS'yi viyale pipetleyin.
HSA'yı şırıngaya çekin. Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Şırınga iğnesini çıkarın ve yerine filtreyi takın.
HSA'yı filtre aracılığıyla HBSS şişesine enjekte edin ve vorteksle iki kez karıştırın; diğer malzemeleriniz hazır olduğunda ve oda sıcaklığındayken, yaklaşık 15 mililitre tam kan temin edin. Bu işlem, 10⁸ nötrofil içeren 10 ila 15 mililitre ürün sağlayacaktır. Donör, kan örneğini vermeden önceki 24 saat boyunca alkol veya reçetesiz ilaç kullanmamış olmalıdır.
Bunlar ayırma işlemini bozabilir. Tam kan, bir birim K üç EDTA sodyum sitrat veya üretici talimatlarına uygun olarak heparin ekleyerek dokuz birim kan ile antikoagüle edilebilir. Bu prosedürde aşağıdaki adımlar açıklanacaktır.
Plazmayı ve monositleri ayırarak uzaklaştırın. Eritrositleri lizleyerek kırmızı kan hücrelerinden arındırılmış nötrofil tabakasını ayırın ve ilk ayırmada nötrofilleri süspansiyon haline getirip elde edin. NIM tabakasındaki nötrofilleri toplayın.
Santrifüj tüpüne beş mililitre izolasyon medyası toplayın. İzolasyon medyasını tüpün daha altına yerleştirmek, santrifüjün kanı dikkatlice aşağı doğru itecek olması nedeniyle medyanın bir filtre görevi görmesini sağlar. Temiz bir ayrım için NIM üzerine beş mililitre kan ekleyin.
Çözeltilerin birbirine karışmamasına çok dikkat edin. Santrifüjleme sırasında karışmayı önlemek için bu adımı yavaşça, dikkatle ve pipet ucunuzu ayırıcı ortamın yüzeyine yakın tutarak gerçekleştirin. Çözeltiyi 500 RCF'de 35 dakika boyunca santrifüjleyin.
20 ila 25 °C'de, kan altı belirgin banda ayrılmalıdır. Bu altı bant; plazma, monositler, izolasyon medyumu, nötrofiller, tekrar izolasyon medyumu ve en altta kırmızı kan hücresi peletidir. Eğer bu altı bant net ve belirgin değilse, ayırma işlemi temiz gerçekleşmemiş demektir ve işlemin tekrarlanması gerekir.
Kötü ayrışmanın yaygın nedenleri arasında, eski izolasyon medyası, donörün son 72 saat içinde alkol tüketmiş olması veya donörün Tylenol ya da aspirin gibi diğer ilaçlar kullanmış olması yer alır. Plazma monositlerini ve izolasyon medyasını dikkatlice uzaklaştırın ve atın. Bu tabakaları sızdırmaz bir tüpe yerleştirip dikkatlice atın; mümkün olduğunca fazla nötrofil geri kazanmak için nötrofil tabakasını ve nötrofillerin altındaki tüm izolasyon medyasını temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin.
Alt katmandaki izolasyon ortamlarından bir miktar eklemek genellikle en kolay yöntemdir. Alttaki pellet'i rahatsız etmeyin. İkinci deklarasyon, nötrofil katmanını rafine edin.
Nötrofil solüsyonunu kalsiyum içermeyen HBSS ile 10 mililitreye tamamlayın. Hücreleri süspand etmek için tüpü birkaç kez altüst edin ve nötrofil solüsyonunu santrifüjleyin.
10 dakika boyunca 350 RCF. 20 ila 25 derece santigrat sıcaklıkta, tüpün dibinde nötrofilleri ve kalıntı eritrositleri içeren kırmızı bir pelet oluşmuş olmalıdır. Süpernatantı pipetle uzaklaştırın.
Dikkatli olun; eritrositleri liz ederken dipteki peleti dağıtmamaya özen gösterin.
Numunedeki kırmızı kan hücreleri artık lizis yoluyla parçalanmalıdır. Kalan kırmızı kan hücrelerini liz etmek için, tüpe iki mililitre kırmızı hücre lizis tamponu ekleyerek yeniden süspandirin. Peleti süspande etmek için tüpü üç ila dört ayarında vortekslleyin.
Nötrofillerin aktive olmasına neden olabileceği için vorteks ayarını dörtten yukarı çıkarmaktan kaçının. Peleti çözmek için birkaç saniye vortekslenmek veya vorteksin kısa aralıklarla (puls) çalıştırılması gerekebilir. Lizis solüsyonunu 250 RCF'de beş dakika santrifüjleyin.
Numuneye verilen zararı minimize etmek için yumuşak başlatma (soft start) seçeneğini kullanın. Üst fazı (süpernatantı) pipetle alın. Lizis işlemini tekrarlayın.
Gerekirse, nötrofil süspansiyonunu serbest bırakmak için her tüpe 500 microliters kalsiyumsuz HBSS ekleyin. Peleti üç ila dört ayarında vorteksleyin, kalsiyumsuz HPSS ile 10 milliliters hacme seyreltin ve santrifüjleyin. Nötrofilleri 250 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, ardından üst fazı aspire ederek atın.
Pelleti, 250 µL HSA içeren HBSS çözeltisi ile yeniden süspanse edin; genellikle mililitre başına 2 × 10⁶ nötrofil toplanır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, standart bir yoğunluk gradyanı ayırma tekniği kullanarak tam kandan insan nötrofillerin izole edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Nötrofiller, inflamatuar immün yanıtta kritik bir rol oynar ve izolasyonlarının anlaşılması, ileri araştırmalar için hayati önem taşır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Sinirbilim
Arka Plan
- Nötrofiller, inflamatuar yanıtlarda ilk müdahale eden hücreler arasındadır.
- İşlevleri ve mekanizmaları in vitro olarak kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır.
- Nötrofil davranışlarını ve işlevlerini incelemek için izolasyon teknikleri esastır.
- Standardize edilmiş yöntemler, araştırmalarda tekrarlanabilirliği artırır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan kanından nötrofillerin izole edilmesi için güvenilir bir yöntem göstermek.
- Enflamasyondaki nötrofil fonksiyonları üzerine yapılacak ileri araştırmaları kolaylaştırmak.
- Laboratuvarlarda kolayca benimsenebilecek bir protokol sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yoğunluk gradyanıyla ayırma yöntemi.
- Ticari olarak mevcut ayırma ortamlarının kullanımı.
- Ekipmanlar arasında santrifüj ve tüpler yer almaktadır.
- Kalsiyum klorür ve insan serum albümini içeren HBSS kullanılarak solüsyonların hazırlanması.
Temel Sonuçlar
- Tam kan örneklerinden nötrofillerin başarıyla izole edilmesi.
- Ayırma yönteminin etkinliğinin gösterilmesi.
- Araştırmacılar için net bir protokol sunulması.
- Çeşitli koşullar altında nötrofil davranışlarının incelenmesinde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Sunulan yöntem, nötrofil izolasyonu için etkilidir.
- Bu protokol, immün yanıtlar üzerine yapılan araştırmaları geliştirebilir.
- İlerideki çalışmalar, bu izolasyon tekniği üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Değeri
Güvenilir nötrofil izolasyonu, erken aşama immünoloji ve inflamasyon araştırmalarının temelini oluşturarak, ilaç keşif süreçlerinde hassas fonksiyonel çalışmalara ve mekanistik risk azaltma çalışmalarına olanak tanır. Yüksek saflıktaki ve yüksek canlılıktaki nötrofil preparasyonları, güçlü hedef doğrulamayı ve kantitatif analiz geliştirme süreçlerini destekleyerek, portföyün kritik karar noktalarındaki öngörü güvenini doğrudan etkiler. Standartlaştırılmış izolasyon protokolleri, keşif ve translasyonel ekipler arasında tekrarlanabilirliği ve fonksiyonlar arası veri entegrasyonunu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- İnflamasyon ve onkoloji ile ilgili nötrofil spesifik yolakların ve immün mekanizmaların sorgulanmasına olanak tanır.
- Alt analizler için saf, canlı nötrofil popülasyonları sağlayarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Biyolojik belirsizliği azaltarak, erken aşama hipotez testlerinde öngörüye dayalı güveni güçlendirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Tekrarlanabilir in vitro analizler için standartlaştırılmış, yüksek canlılığa sahip nötrofil örnekleri sağlar.
- Fagositoz ve sitokin üretimi gibi nötrofil fonksiyonlarının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır.
- Bileşik tarama ve mekanistik çalışmalar için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını mümkün kılar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Preklinik sistemlerde inflamatuar yanıtların modellenmesi için hastalıkla ilgili hücresel materyal sağlar.
- Hücre fonksiyonunu ve canlılığını koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- İnsan bağışıklık hücrelerinde fonksiyonel okumalar sağlayarak translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yoğunluk gradyanlı nötrofil izolasyon protokolü, erken keşif ve assay geliştirme arasındaki arayüzle bütünleşerek, hedef doğrulamadan preklinik araştırmalara kadar olan iş akışlarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Hipotez odaklı fonksiyonel çalışmalar ve yolak analizleri için saf nötrofiller sağlar.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif hücre bazlı assay girişleri sunar.
- Analitikler: Karşılaştırmalı analizler için hücre canlılığının, saflığının ve fonksiyonel çıktıların ölçülmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Primer insan bağışıklık hücrelerini kullanarak in vitro bulguları preklinik modellere bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla araştırma programı ve hastalık alanı genelinde uygulanabilir, standartlaştırılmış bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bağışıklık hücresi çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Nötrofil tabanlı analizlerin tekrarlanabilirliğini, standartlaştırmasını ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Güçlü erken veriler sağlayarak go/no-go karar kalitesini ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: İnflamasyon ve immünoloji varlıklarının riskten arındırılmış önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Yoğunluk gradyanlı ayırma ve hücre işleme konusunda teknik uzmanlık gerektirir.
- Santrifüg ekipmanına, steril reaktiflere ve valide edilmiş ayırma ortamlarına erişim gereklidir.
- Hücre canlılığını korumak için zamanlama ve sıcaklık kontrollerine kesin uyum gerektirir.
- Çalışmalar arasında tekrarlanabilir sonuçlar için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Donör değişkenliği ve nötrofillerin kısa yaşam süresi ile sınırlıdır; bu durum hızlıca alt işlemlere geçilmesini gerektirir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
