Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre
12 Haziran 2008
Hücreleri confluency ulaşmak, pasajlandı veya geçişli olmalıdır. Bu video yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de alt kültüre için bir prosedür gösterecektir.
Doku kültürü teknolojisi, hücre biyolojisi alanında geniş uygulama alanı bulmuştur. Ancak, kültüre edilmiş hücrelerin sağlıklı kalmaları için düzenli bakıma ihtiyaçları vardır. Hücreler konfluense ulaştığında, alt kültüre alınmalı veya pasajlanmalıdır.
Bunun yapılmaması, büyümenin azalmasına ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar. Bu videoda, hemlezyonel hem de süspansiyon hücre hatları için doku kültürü hücrelerinin nasıl sürdürüleceğini gösteriyoruz. Merhaba, ben Ricky; Doğu Tennessee'deki Moleküler Patoloji Laboratuvarları Ağının Dr.LAN Laboratuvarındayım.
Bugün size süspansiyon ve yapışkan hücrelerin pasajlanması için iki teknik göstermek istiyorum. Bir hücre plağını pasajlamak için, 60 mm'lik bir Petri kabında veya beş mL doku kültürü ortamı içeren 25 cm²'lik bir doku kültürü flaskında konfluense ulaşmış bir primer kültürle başlayacağız.
Steril pipet yardımıyla primer kültürdeki tüm besiyerini uzaklaştırarak başlıyoruz. Ardından, bir sonraki adımda eklenecek olan tripsin enziminin etkisini inhibe edebilecek artık fetal bovin serumu kalıntılarını gidermek için, yapışık hücre monokatmanını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 37 °C HBSS'nin küçük bir hacmiyle bir veya iki kez yıkıyoruz.
Ardından, adherent hücre tabakasını kaplayacak miktarda ılık trypsin EDTA çözeltisini kültüre ekleyin. Daha sonra plakayı bir ila iki dakika boyunca 37 °C sıcaklıktaki bir ısıtma tepsisine yerleştirebilirsiniz. İnkübasyonun ardından, hücreleri yerinden ayırmak için plakanın alt kısmını düz bir yüzeye hafifçe vurun.
Hücrelerin yuvarlaklaştığından, yani yüzeyden ayrıldıklarından emin olmak için kültürü ters mikroskop altında kontrol edin. Hücreler yeterince ayrılmamışsa, plakayı bir veya iki dakika daha ısıtma tepsisine geri koyun. Mikroskopla inceleme yaptıktan sonra, kabı tam besiyeri ile durulayın ve süspansiyonu, içinde 2 ml tam besiyeri bulunan 15 ml'lik konik tüpe pipetle aktarın.
Hücreleri pelletlemek için santrifüjleyin ve pelletlemi komple ortamda yeniden süspande edin. Şimdi, uygun şekilde etiketlenmiş her bir yeni plakaya eşit hacimde hücre süspansiyonu ekleyin. Alternatif olarak, hücreler bir hemositometre kullanılarak sayılabilir ve her bir plakaya belirli sayıda hücre eklenebilmesi için istenen yoğunluğa kadar dilüe edilebilir.
Her plaketi subkültür tarihi ve pasaj numarası ile etiketlediğinizden emin olun. Hücre süspansiyonunu ekledikten sonra, her yeni kültüre 1 mL taze besiyeri ekleyin. Ardından plaketleri nemlendirilmiş 37 °C %5 CO2 inkübatöründe inkübe edin.
Hücreleri gece boyunca inkübe ettikten sonra, plakalara taze besiyeri ekleyin ve plakaları tekrar 37 °C'ye yerleştirin. Plaka konfluense ulaştığında, bu prosedürü tekrarlayarak plakayı tekrar pasajlayabilir ve gerektiği şekilde pasajlamaya devam edebilirsiniz. Şimdi size süspansiyon kültüründeki hücrelerin nasıl pasajlanacağını göstereceğiz.
Süspansiyon kültüründeki hücrelerin paketlemesi, adherent hücrelere göre daha basittir. Süspansiyon kültürleri paketlenmeden önce, hücreler konfluense ulaşana kadar her iki ila üç günde bir beslenerek sürdürülmelidir; konfluens, hücrelerin süspansiyon içinde topaklandığı ve flask çalkalandığında medyum bulanık göründüğü aşamadır.
Bunu yapmak için, flasksa çökmüş olan hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süspansiyon hücrelerinin bulunduğu flaskı inkübatörden çıkarın. Aseptik koşullarda flasktaki ortamın yaklaşık üçte birini boşaltıp atın ve yerine 37 °C'de önceden ısıtılmış eşit hacimde ortam ekleyin. Ortamı değiştirdikten sonra flaskı dairesel hareketlerle sallayın ve 37 °C, %5CO2 değerlerine ayarlanmış inkübatöre geri yerleştirin.
Eğer flaskta 15 mL'den az besiyeri varsa, hücrelerin besiyeri ile temasını artırmak için flaskı yatay pozisyonda inkübe edin. Aksi takdirde, kültürlerin beslenmediği günlerde flasklar dikey olarak inkübe edilebilir. Hücreleri yeniden süspande etmek için flaskları çalkalayarak kontrol edin.
İyi metabolik büyümeye işaret eden ortamdaki renk değişimlerini gözlemlediğinizden emin olun. Kültürler konfluen hale geldiğinde, ki bu yaklaşık mil başına 2,5 milyon hücreye karşılık gelir, onları pasajlayabilirsiniz. Bir kez daha, hem adherent hem de süspansiyon kültürleri için kültüre edilmiş hücrelerin nasıl pasajlanacağını göstermiş olduk.
İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, tüm deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, konfluense ulaşan hem adherent hem de süspansiyon hücrelerin pasajlanma prosedürünü göstermektedir. Kültürlenen hücrelerin uygun şekilde sürdürülmesi, hücrelerin büyümesi ve canlılığı için temel öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Doku Kültürü Teknikleri
- Hücre Bakımı
Arka Plan
- Doku kültürü teknolojisi, hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılır.
- Düzenli bakım, kültüre edilmiş hücrelerin sağlığı için kritik öneme sahiptir.
- Büyümenin azalmasını ve hücre ölümünü önlemek için hücreler pasajlanmalıdır.
- Bu video, hücre hatlarının sürdürülmesi konusunda pratik rehberlik sağlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Farklı hücre tipleri için pasajlama sürecini göstermek.
- Araştırmacıları hücre canlılığının sürdürülmesi konusunda eğitmek.
- Laboratuvar prosedürleri için görsel bir kılavuz sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sübkültür tekniklerinin gösterimi.
- Adherent hücre hatlarının kullanımıyla ilgili talimatlar.
- Süspansiyon hücre hatlarının kullanımıyla ilgili talimatlar.
- Prosedürlerin anlaşılmasını kolaylaştıran görsel yardımcılar.
Temel Sonuçlar
- Sübkültürleme yöntemlerinin başarılı bir şekilde gösterimi.
- Araştırmacılar için net görsel talimatlar.
- Zamanında pasajlamanın önemine vurgu.
- Sağlıklı hücre kültürlerinin sürdürülmesine yönelik rehberlik.
Sonuçlar
- Hücre sağlığı için uygun şekilde alt kültürleme yapılması esastır.
- Araştırmacılar görsel öğrenme kaynaklarından faydalanabilirler.
- Kültürlenmiş hücrelerin sürdürülmesi düzenli dikkat gerektirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Memeli hücrelerin güvenilir şekilde alt kültürlerinin oluşturulması, Ar-Ge süreçlerinde tutarlı hücre sağlığını ve deneysel sürekliliği sağlayarak tekrarlanabilir keşif biyolojisinin temelini oluşturur. Standartlaştırılmış tripsinizasyon ve pasajlama protokolleri, biyolojik değişkenliği azaltarak sağlam assay geliştirme ve alt akış taramalarını destekler. Etkili hücre bakımı, erken evre hedef doğrulama ve translasyonel araştırmalardaki öngörüsel güveni pekiştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hipotez odaklı deneyler için hücre hatlarının tutarlı propagasyonuna olanak tanır.
- Biyolojik gürültüyü azaltarak fonksiyonel hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Yeniden üretilebilir yolak sorgulamasını ve farklı koşullar arasında karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Deney kurulumu ve bileşik taraması için standartlaştırılmış hücre popülasyonları sağlar.
- Tekdüze hücre yoğunluğu ve canlılığını koruyarak kantitatif çıktı üretimini destekler.
- Tekrarlanabilir subkültür teknikleri aracılığıyla ölçeklenebilirliğe ve platformun yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Uygun olduğunda, translasyonel biyobelirteç çalışmaları için hastalıkla ilgili hücre modellerini sürdürür.
- Hücre hattı bütünlüğünü koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği sağlar.
- Güvenilir hücre temelli veriler aracılığıyla risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Tripsinizasyon ve alt kültürleme, erken hipotez testlerinden analiz geliştirmeye ve preklinik araştırmalara kadar uzanan iş akışlarını destekleyerek, keşif sürecinin temelini oluşturur.
- Keşif Biyolojisi: Güçlü deneysel tasarım ve yolak analizi için sağlıklı, proliferatif hücreleri korur.
- Tarama: Yüksek güvenilirlikli assay uygulamaları ve bileşik değerlendirmeleri için tekrarlanabilir hücre popülasyonları sağlar.
- Analitik: Hücre büyümesinin, viabilitesinin ve perturbasyonlara verilen yanıtın kantitatif ölçümünü sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Keşif ve preklinik aşılar arasında köprü kuran çalışmalar için model sadakatini korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Programlar genelinde hücre hattı bakımı için standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre tabanlı çalışmalarda öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Hücre kültürü iş akışlarında standartlaşmayı, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği teşvik eder.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/durdur kararlarını ve sermaye açısından verimli portföy ilerlemesini destekler.
- Portföy Etkisi: Keşif ve preklinik varlıkların riskle uyumlu önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Steril teknik ve hücre yönetimi konusunda teknik uzmanlık gerektirir.
- Doku kültürü tesislerine, inkübatörlere ve valide edilmiş reaktiflere erişim gereklidir.
- Subkültür aralıklarının ve dokümantasyonun ekipler arası standart hale getirilmesini gerektirir.
- Protokoller, spesifik hücre hattı büyüme hızlarına ve özelliklerine göre uyarlanmalıdır.
- Aşırı konfluenslelemi önlemek ve hücre sağlığını korumak için düzenli izlemeye bağlıdır.
