Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

Ben JohE Hvar, Almanya'nın Hamburg şehrinde bulunan HE Pet Enstitüsü'ndeki Hücre Biyolojisi ve Biyoloji Bölümü'nde görev yapmaktayım. HE PET Enstitüsü, yalnızca insan pe, patojenik virüsler ve buna bağlı konular üzerine odaklanan bir temel araştırma enstitüsüdür. Bölümümüz öncelikli olarak HIV gen ekspresyonunun düzenlenmesini ve özellikle HIV'in konak hücre bileşenleriyle hücre içi etkileşimlerini araştırmaktadır.

Bu verilere dayanarak, HIV hastalığı için yeni ve deneysel tedaviler geliştirmeye de çalışıyoruz. HIV ile ilgili sorun, HIV'in bir retrovirüs veya lentivirüs olmasıdır ve her retrovirüs gibi HIV, konak hücreye enfeksiyon sırasında viral genomu konak hücre genomuna entegre eder. Şu ana kadar, entegre olmuş provirüsten kurtulmak mümkün olmamıştır.

Bu durum, terapi açısından ömür boyu tedavi gerektiren kronik bir hastalıktan ve temel olarak ilaçların yan etkileri, direnç gelişimi ve benzeri ömür boyu süren tedavilere bağlı tüm sorunlardan bahsettiğimiz anlamına gelir. Uzun yıllardır temel araştırmalarda, örneğin mayalarda veya bakterilerde doğal olarak gerçekleşen rekombinasyonlarda görülen, rekombinaz olarak adlandırılan enzimleri biliyoruz. Bu rekombinazlar, spesifik DNA dizilerini tanır, genleri karıştırır, genomu yeniden düzenler ve benzeri işlemler gerçekleştirirler.

Ve özellikle, temel araştırmalarda ve in situ çalışmalarda kullanılan Cre rekombinaz adlı bir rekombinaz kullanılır. Cre temel olarak kendi spesifik dizisini tanır ve iki tanıma bölgesi arasında yer alan bir dizi varsa, Cre temel olarak aradaki diziyi kesip çıkarmakla yetkindir.

Söz konusu fikir, yaklaşık 10 veya 15 yıldır tıpta virüsü tamamen yok etmek ve diğer yandan, örneğin Crele gibi bir rekombinaz kullanarak proviral DNA'yı kesip çıkarmak üzerine kuruludur; bu, teoride mümkün olmalıdır çünkü enfeksiyon sırasında HIV, RNA genomunu DNA'ya ters yazıya geçirir ve bu ters yazı süreci sonucunda, temel olarak entegre proviral DNA'nın 5' ucunu (başlangıcını) ve 3' ucunu (sonunu) işaretleyen uzun terminal tekrarları (LTR) adı verilen diziler oluşturulur. Dolayısıyla teoride, LTR içindeki bir diziyi spesifik olarak tanıyan bir rekombinasyon mekanizması geliştirilebilirse; Cre, entegre proviral DNA'nın 5' ucuna ve 3' ucuna saldırarak DNA'yı kesip çıkarabilir ve böylece virüsü enfekte olmuş hücreden tamamen temizleyebilir. Ancak HIV ile ilgili sorun, belki tek bir kişide, tek bir hastada bile farklı izolatların bulunmasıdır; buna rağmen, bildiğimiz kadarıyla bu diziler viral genomun başlangıcında ve sonunda yer almaktadır.

Yani diğer bir ifadeyle, LTR'ler örneğin HIV genlerine göre daha korunmuştur. Bu nedenle, tüm HIV izolatlarının geniş çeşitliliğini temel olarak tanıyan az sayıda rekombinant ile sonuç alabileceğimize dair iyi bir şans olduğunu düşünüyorum. Eğer böyle olmazsa, gelecekte yarı otomatik hale getirilebilecek moleküler evrim yoluyla yeni bir tane üretmemiz gerekecektir.

Ve öyle olacak, bu işlem laboratuvarda yapmaktan çok daha hızlı gerçekleşecek. Meslektaşımız, Max Splunk Enstitüsü'nden Dr. Frank, sürecin sonunda devreye girdi. Temelde kendisi rekombinaz ve ilgili her konuda bir uzmandır.

Temel olarak kullandığı yöntem, moleküler evrim yöntemi olarak adlandırdığımız yöntemdir. Ancak bu yöntem, PCR polimeraz zincir reaksiyonu teknolojisine dayanmaktadır. Doğal olarak oluşan rekombinaz Drekomb'un genini alır ve rastgele mutasyonların oluşmasını sağlayacak koşullar altında bir PCR veya birden fazla PCR reaksiyonu kurar.

Şimdi buradaki püf noktası, yeni bir kapasite veya yeni bir aktivite, yani HIV'e özgü dizileri tanıma yeteneği kazanmış rekombinazın yeni versiyonlarını seçmektir. Ve bunu tekrarlayan döngüler halinde yapmaktadır. Bu tür bir moleküler evrim yöntemini uygulamak için yaklaşık 120 veya 120'den fazla döngü gerçekleştirmiştir.

Sonunda, şu an LTR'ye özgü rekombinaz olarak adlandırılan ve artık spesifik olarak HIV dizilerini tanıyan bu yeni rekombinazı geliştirdiğinde; buradaki ilk çalışma, rekombinantlarla yapılan deneylerin Hamburg'daki HE PET Enstitüsü'nde gerçekleştirilmesiydi. Yaptığımız işlem, özellikle bu rekombinazı, aşağı yukarı bir klinik HIV-1 izolatı ile enfekte edilmiş insan hücre kültürlerine gen vektörleri aracılığıyla iletmekti.

Ve zamanla, altı ila sekiz hafta boyunca, bunu kanıtlayabilmiştik. Şu an rekombinant miktar olarak heyecan verici; HIV profilini entegre ettiler, temel olarak tüm kültür HIV'den kurtularak iyileşti. Bu teknolojiyle ilgili kesinlikle çok sayıda sorun bulunmaktadır.

Öncelikle, rekombinaz ekspresyonunun toksik yan etkilere yol açmadığından emin olmamız gerekir. Bunu beklemiyoruz çünkü cre gibi doğal olarak meydana gelen rekombinasyonlar için sözde transgenik hayvanlar mevcuttur. Bunlar bu CRE rekombinasyonunu eksprese ederler ve evet, bazı sorunlar vardır ancak bunlar çok belirgin değildir.

Şu aşamada böyle söyleyebilirim. Dolayısıyla toksik yan etkilerin olmadığına dair bir umut var, ancak deneyleri yapana kadar asla bilemezsiniz. Ayrıca, her klinik izolatı bununla tanıyamayabileceğimiz sorunlar da mevcut; bu da hastadaki baskın HIV izolatından kurtulmamızı engelleyebilir.

Ancak zamanla küçük, küçük izolatlar arasından seçim yapacağız. Bu, henüz bilmiyoruz, bu deneyleri yapmamız gerekiyor. Ardından gen iletiminde ve vektör teknolojisinde büyük bir sorunla karşılaşıyoruz.

Geni veya rekombinaz genini iletmek için sözde lentiviral vektörler veya retroviral vektörler kullanmamız gerekiyor. Peki, yan etkiler var mı? Var; bu vektörler toksik etkilere neden oluyor mu?

Tüm sorularımız bunlardır. Ayrıca, tarakların aktivitesini artırmayı umuyoruz. Rekombinasyon, şu an gördüğümüzden, son birkaç haftadır, daha hızlı gerçekleşiyor olabilir.

Bu nedenle, önümüzdeki yıllarda üzerinde çalışmamız gereken tüm bunlar açık sorulardır. Ve rekombinazlar oral yolla alınamadığı için bu durum şu anda kesinlikle bir problem teşkil etmektedir. Dolayısıyla, sadece bir rekombinaz hapı alıp virüsten kurtulabileceğiniz bir hap mevcut olmayacaktır.

Bu nedenle, gelecekteki tedaviler üzerine spekülasyon yapacak olursak, gen tedavisi yaklaşımlarını düşünmemiz gerekir. Belki de HIV enfeksiyonu olan hastaların kanından sözde hematopoetik kök hücreleri veya CD 34 pozitif hücreleri izole edebileceğimiz düşünülebilir. Ardından laboratuvar ortamında, bu hasta hücrelerine combs genini aktarabiliriz.

Son olarak, hastaya yeniden infüzyon yaparız; yani genetik olarak modifiye edilmiş hasta hücrelerini aynı hastanın sırtına geri enjekte ederiz. Bu durumda olması gereken, hastanın bağışıklık sisteminin veya hematopoetik sisteminin zamanla, HIV enfeksiyonu durumunda virüsü yok edebilen hücrelerle en azından kısmen yeniden yapılandırılmasıdır; çünkü bu hücreler artık bir rekombinaz eksprese etmektedir. Bunun etkisi, hastadaki viral yükün düşmesi olacak ve bu durum kesinlikle yaşam kalitesini artıracaktır.

Ayrıca, bu hastalarda bağışıklık sisteminin en azından kısmen yeniden yapılandığını umabiliriz. Böylece, tam fonksiyonel hale gelen bağışıklık hücrelerinin, bu hastalardaki geri kalan latent enfekte hücrelere saldırabilmesi beklenir. HIV'yi bir hastadan gerçekten tamamen, bütünüyle yok edip edemeyeceğimizi ise şu an için söyleyemeyiz.