Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Sea elegance, hem hücre soyaları hakkındaki bilgimiz hem de tüm genomunun dizilenmesi ve analiz edilmesiyle elde edilen bilgi zenginliği sayesinde inanılmaz derecede kullanışlı bir model organizmadır. Bu videoda, plazmidlerin sea elegance'a mikroenjeksiyon sürecini ve floresan mikroskobu kullanarak transgenik yavruların seçilmesini gösteriyoruz; şeffaf ve çok hücreli bir hayvan olan sea elegance, floresan işaretli proteinler eksprese eden transgenlerin in vivo olarak görselleştirilmesi için idealdir. Merhaba, benim adım Laura Berkowitz ve Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Caldwell Laboratuvarı'nda araştırma görevlisiyim.

Ben de Alabama Üniversitesi, Calwell Laboratuvarı'ndan Adam Knight. Bugün sizlere, transgenik *C. elegans* üretmek için plazmid mikroenjeksiyonuna nasıl hazırlanacağını ve bu işlemin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim. Ayrıca, transgenik *C. elegans* hatlarının nasıl seçileceğini ve sürdürüleceğini göstereceğim. Haydi başlayalım.

Mikroenjeksiyona başlamadan önce, şimdi size göstereceğim birkaç hazırlık adımı bulunmaktadır. İlk olarak, enjekte edilecek plazmit DNA'yı hazırlayın; hedef genimizin dokuya özgü ekspresyonunu kodlayan bir plazmit ve seçilebilir bir transformasyon markörü sağlayan ikinci bir plazmit olmak üzere iki plazmit gereklidir. Plazmitleri, mikrolitre başına 50 nanogram olacak şekilde bire bir oranda karıştırın.

Sıradaki adım olarak, solucanları enjeksiyon için sabitlemek amacıyla kullanılacak olan auger pedlerini hazırlayın. Auger pedlerini yapmak için öncelikle tezgaha birkaç adet 22 x 50 milimetrelik lamellen yerleştirin. Bir pastör pipeti kullanarak bir lammelin üzerine bir damla eritilmiş %2 agroz yerleştirin ve hemen ardından ikinci bir lammeli, ilkine 90 derecelik bir açıyla gelecek şekilde damlanın üzerine koyun.

Aerogelin birkaç saniye boyunca katılaşmasını bekleyin ve ardından üst örtü camını çıkarın. Yassılaşmış aerogel diskinin çapı 15 ile 20 milimetre arasında olmalıdır. Pedin, birkaç saat boyunca veya gece boyunca tamamen havada kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, pedleri oda sıcaklığında bir lam kutusunda saklayın. Ardından, DNA çözeltisi için iğne yükleyicilerini hazırlayın. Bunun için, yüz mikrolitrelik bir kapiler tüp alın, tüpün orta kısmını açık alevde ısıtın ve hızla çekerek yaklaşık iki katı uzunluğa getirin.

Kılcal tüp soğuduktan sonra, iki yarıyı kırarak ayırın. Enjeksiyon için 10 ila 20 adet iğne yükleyiciyi stoklayın. Bunları bir mikro santrifüj tüpünde dik konumda saklayabilirsiniz.

Brack, dikkatli ol. İğne yükleyici uçları çok keskindir. Şimdi mikro enjeksiyon iğnelerini hazırla.

Bu iğneler, içinde dahili bir cam filament bulunan özel bir kapiler tüpten yapılmıştır. Bu filament, DNA çözeltisi için bir fitil görevi görür. İğneleri üretmek için 24,8 ısı ayarına sahip bir Niki PP eight 30 Polar kullanıyoruz; depolama amacıyla aynı anda birkaç iğne çekilmektedir.

Birden fazla iğne, bir şerit modelleme kiline monte edilebilir. Çekilmiş iğne ucunu açmak için küçük lamel cam parçaları kullanılacaktır. Bu parçalar, 18 by 18 milimetrelik bir lamel camın Kim wipe ile sarılıp birkaç parçaya ayrılana kadar nazikçe üzerine baskı uygulanarak hazırlanır.

Yaklaşık üç çarpı dört milimetre boyutunda parçalar kullanın. DNA ve iğneleri hazırlamanın yanı sıra, yaklaşık 50 ila 100 adet uygun evredeki, enjekte edilecek her bir ekspresyon vektörü konstrüktü için ikişer adet wild type solucan hazırlayın.

Artık mikroenjeksiyon mikroskobunu kurmaya hazırız. Mikroskobun kurulumuna başlamak için, mikroenjeksiyon iğne koluna ve tutucusuna bağlı olan helyum tankındaki ana valfi açın. Gazın hatta girmesini sağlamak için regülatörü kapatın.

Basınç 35 PSI'a getirildikten sonra, gaz bir ayak pedalı kullanılarak tahliye edilebilir. Ardından, standart bir ağız pipetleyici tüpüne bir iğne yükleyici yerleştirin ve plazmit karışımından yaklaşık bir mikrolitre gibi küçük bir miktar damlatın. Şimdi, direnç hissedilene kadar yükleyiciyi mikroenjeksiyon iğnesinin tamamen içine yavaşça itin.

DNA çözeltisini hafifçe üfleyerek boşaltın ve ardından yükleyiciyi çıkarın. DNA yüklendikten sonra, iğneyi küçük iç lastik contanın içine yerleştirmeye dikkat ederek mikroenjeksiyon koluna takın ve ardından manipülatör koluna sabitleyin. Sonra, bir kapak camı kırma parçasını bir vidalı pedin kenarına yerleştirin.

Parçayı ve auger pedinin tüm yüzeyini halojen karbon yağı ile kaplayın. Ardından auger pedini bir ters mikroskobun tablasına yerleştirin. Auger pedi yerleştirildikten sonra, Forex objektif ve parlak alan aydınlatması kullanarak iğneyi görüş alanının merkezine konumlandırın, ancak iğneyi henüz yağın içine indirmeyin.

Ardından, lamellek parçasının iç kenarını merkeze konumlandırın ve ona odaklayın. İğneyi, lamellek parçası ile aynı odak düzlemine gelecek şekilde yağın içine indirin. 40 x objektife geçerek büyütmeyi artırın, ardından parçanın kenarına yeniden odaklanın ve gerekirse iğnenin ucunu yeniden konumlandırın.

Şimdi enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. Ayak pedalı aracılığıyla kısa bir gaz darbesi uygularken, aynı zamanda iğneyi lam parçasının kenarına hafifçe itin. İğnenin ucu yeterince kırılmış olacaktır.

İğnenin ucundan, aşırı sıvı akışı nedeniyle küçük sıvı damlacıklarının sızması, hayvanları öldüreceği için istenmeyen bir durumdur. İğne hazır olduğunda mikroenjeksiyona başlarız. Ardından, iğneyi yukarı kaldırarak auger pedini sahneden çıkarın.

Ancak X veya Y ekseni konumunu değiştirmeyin. Sahneyi iğnenin altından kaydırarak dışarı çıkarın. Auger pedini çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin.

Bir solucanı, yağ yüzeyinin altındaki pedin üzerine transfer edin. Solucan kıvranırsa, auger pedi ile temas edene kadar onu nazikçe okşayın; nemli solucan kuru agroya yapışmalıdır. Auger pedi, solucanı görüş alanının merkezine gelecek şekilde hızla tekrar sahne üzerine yerleştirin.

Ardından iğneyi, solganla aynı odak düzlemine indirin. Ters mikroskoptaki filtreleri Hoffman aydınlatmasına getirin. Bu kontrast filtresi, solganın morfolojik detaylarının görünür hale gelmesini sağlar.

40x objektif kullanarak, solucan gonadının germ çekirdeklerinin petek deseninin altında kalan granüllü duyusal merkezine odaklanın. Solucanın iğneye bakan tarafında konumlanmış olan herhangi bir gonadı seçin. İğnenin ucu da odaklanana kadar iğnenin konumunu hassas bir şekilde ayarlayın.

İğneyi nazikçe gonadın merkezine yerleştirin ve gonad koluna bir veya iki damla DNA göndermek için kısa bir gaz basıncı uygulayın. Çokça pratik ve beceriyle, sıvının distal gonad boyunca yayılan bir dalgasını gözlemlemelisiniz. Gonad merkezini her seferinde isabetle vurabilirsiniz.

Bir solucana enjeksiyon yaparken hızlı çalışmanın önemli olduğunu unutmayın. Çünkü solucan kolayca kuruyabilir. Tüm işlem ideal olarak bir ila iki dakikadan kısa sürmelidir.

Enjeksiyon tamamlandığında, auger pedini sahneden kaldırın ve bir diseksiyon mikoskobuna yerleştirin. Enjekte edilen solucanağa doğrudan bir mikrolitre M9 tamponu uygulayın. Bu işlem, pipet ucunun halo karb yağı yüzeyinin altına daldırılmasını gerektirebilir.

Tampon çözelti solucanı yeniden nemlendirmeli ve böylece solucan aeros ped yüzeyinden ayrılıp yukarı çıkacaktır; solucanı bir solucan toplama çubuğu kullanarak standart bir plakaya aktarın. Şimdi, enjekte edilen solucanları Adam'a devredeceğim ve o da bize transgenik hatların seçimi ve sürdürülmesini gösterecek. Enjekte edilen solucanlar, taze ekilmiş bireysel 60 milimetrelik plakalara aktarılır ve üremelerine izin verilir.

Bu solucanlar P sıfır neslini temsil eder. Genellikle enjekte edilen hayvanlar, yavrular ortaya çıkana kadar 20 °C'de iki ila üç gün inkübe edilir. Yavrular göründüğünde, transgenik solucanlar için taramaya başlamaya hazırız.

F1 dölü, transgenik belirteç kanıtları açısından gözlemlenir. Bu durumda, seçilebilir belirteç floresan özelliktedir, bu nedenle floresan stereo mikroskop kullanarak tarama yapabiliriz. Floresan taşıyıcı olan her bir F1 hayvanı, ayrı ayrı yeni bir plakaya klonlanır.

Enjekte edilen P sıfır, tüm F1 yavruları arasında yalnızca bir ila beş floresan yavrular üretebilir. F1 hermafroditlerinin, yavrular görünene kadar 20 °C'de iki ila üç gün boyunca üremesine izin verin. F iki nesli hazır olduğunda, onlar da transgenik hayvanlar açısından gözlemlenir. Transgenik bir markörü miras almış ve eksprese etmiş olan F iki hayvanları, stabil bir hat olarak kabul edilir.

Her bir bağımsız stabil hat, ayrı bir solucan hattı olarak korunmalı ve her nesilde birkaç transgenik hayvan yeni bir plakaya aktarılarak her hat çoğaltılmalıdır. Bu işlem floresan stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Seçilebilir marker floresan ise, gen kopya sayısındaki değişkenliği kontrol etmek için, enjekte edilen konstrükt başına en az üç bağımsız stabil hat oluşturun.

Ekspresyon vektör konstrüktlerinin nasıl mikroenjekte edileceğini, nasıl seçileceğini ve stabil hatların nasıl belirleneceğini gösterdik. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.