Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Caldwell Laboratuvarı'nda, yani diğer adıyla Worm Shack'te, C. elegans'taki nörolojik hastalık mekanizmaları üzerine çalışıyoruz. Verimli deneylerle geçen uzun bir günün ardından, kendimizi bazı rekreasyonel aktivitelerle ödüllendiriyoruz. Merhaba, ben Adam Knight; Alabama Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü, Caldwell Laboratuvarı'nda lisans öğrencisiyim.

Bugün, ben ve diğerleri C. elegans'ta dopamin nöron dejenerasyonu analizi nasıl yapılır göstereceğiz. Dopamin nörodejeneratif bir solucan suşunu, aday hastalık ilişkili genleri ve dopamin nöronlarını aşırı ifade eden transgenik suşlarla çaprazlayacağım. Merhaba, ben Caldwell Lab'da yüksek lisans öğrencisi Adam Harrington.

Bugün size dopamin nöron analizleri için transgenik solucanların nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Merhaba, ben lisansüstü öğrencisi Shu Amichi. Burada size, CEP ve AID olarak adlandırılan C. elegans dopamin nöronlarının nasıl analiz edileceğini göstereceğim.

Genel olarak, dopamin nöronlarında sadece GFP ekspres eden solucanlar hücre ölümü sergilemezler. Ancak, CLE varlığında, bunları ve yaşa bağlı nörodejenerasyonu gözlemleyeceksiniz. Bu analiz kullanılarak, bir transgenin CLE kaynaklı toksisiteyi artırıp artıramayacağını veya baskılayıp baskılayamayacağını belirlemek için dopamin nöronlarında ko-eksprese edilmesi sağlanabilir. Öyleyse hadi başlayalım.

Dopamin nöron analizini gerçekleştirmeden önce, öncelikle uygun GaN suşlarını çaprazlamalı ve hem alphas nucle ve GFP'yi dopamin nörona özgü dat one promotörü kontrolünde eksprese eden sekiz adet mill'i çiftleşme plakasına yerleştirmeliyiz. Şimdi, ilgi duyulan aday genimizin dopamin nörona özgü ekspresyonunun yanı sıra DS red two floresan seçilebilir işaretçisinin vücut duvarı kas hücresi ekspresyonunu sergileyen iki adet L4 evresi transgenik ca afrodit ekleyin. Her bir transgen konstrüktü için üç stabil transgenik hat oluşturduğumuzu belirtmek önemlidir.

Bu nedenle, bu genetik çaprazlama oluşturulan üç ayrı stabil hattın her biri için bireysel olarak gerçekleştirilmelidir. İki gün sonra erkekleri çıkarın ve ek iki ila üç gün sonra imha edin. F1 neslini inceleyin.

Çeşitli erkek döl bulunmaktadır ve çiftleşme başarılı geçmiştir. Ardından, erkek ebeveynden kalıtılan GFP floresan belirteci ile hamadi ebeveynden kalıtılan DS red two floresan vücut duvarı kas belirtecinin her ikisini de sergileyen beş Aphrodite L four hayvanını ve her çaprazlamadan dört hayvanı tek tek yeni plakalara aktarın. Aktarılan hayvanların, henüz çiftleşmediklerinden emin olmak için L four evresinde olmaları gerekir.

Erkek hayvanlar plakta bulunurken, F2 dölünü üretmek için hayvanların üç ila dört gün boyunca kendi kendilerini döllemelerine izin verin. Şimdi, bunu yapmak için F2 dölünü temizleyin. Her iki sent marker'ı da sergileyen beş ila 10 hayvanı kendi bireysel plakalarına aktarın.

Ardından, hayvanların yüzde yüzünün dopamin nöronlarında GFP eksprese ettiği ve bazı hayvanların vücut duvarı kas hücrelerinde DsRed2 floresan markörünü eksprese ettiği plakalar için F3 neslemini tarayın. Bu hayvanlar, alfa-sinüklein ve GFP genleri için homozigot olacak ve yeni oluşturulan transgeni stabil bir şekilde ileteceklerdir. Tarama tamamlandığında, dopaminerjik nöron analizini gerçekleştirmeye hazırız.

Nöron analizine başlamak için, önceki adımda belirlenen üç F hayvanından taze bir plaka hazırlayın. Üç transgenik hattın her biri için bir plaka düzenleyin. Ek olarak, kontrol olarak sadece alfa-sinüklein GFP suşunu platlayın ve solucanların yetişkinliğe erişmesini sağlayın.

Solucanlar yetişkinliğe ulaştığında, her hattan 30 ila 40 transgenik hayvanı taze bir plakaya aktarın. 20 °C'de beş saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin. Beş saat sonra hayvanları uzaklaştırın ve atın.

Erişkinler, embriyoların 20 °C'de L4 evresine ulaşana kadar üç ila dört gün gelişmesine izin verilir. Ardından, yaklaşık yüz adet transgenik L4 hayvan, 0,04 mg/mL 5-fluorodeoksiuridin içeren bir plakaya alınır.

Bu nükleotid analoğu, DNA sentezini inhibe ederek bir sonraki neslin gelişimini önler. FDUR plakaları ışığa duyarlı olduğundan, plakaları örtülü ve tamamen sarılı tutarak ışıktan koruyun. Solucan analizi için bir aug gross pedi hazırlayın.

Bunlar taze olarak kullanılır ve kurumalarına izin verilmez. Üzerine boylamasına bir parça bant yapıştırılmış iki mikroskop lamı hazırlayın. Bant, eş kalınlıkta pedler oluşturmak için ara boşluk görevi görür.

Tezgaha, aralarına üçüncü bir lam yerleştirin. Konumlandırıldılar. Yan yana üç tane.

Erimiş agarın bir damlasını lamın merkezine yerleştirin ve dik açı oluşturacak şekilde başka bir lamı üzerine, ardından tüm üç lamı kapsayacak şekilde yerleştirin. Analiz edilecek örnek sayısına uygun sayıda ek agar pedi hazırlamak için işlemi tekrarlayın. Agar pedleri hazır olduğunda, 22 x 30 milimetrelik bir kapatma camı üzerine altı mikrolitre miktarda üç milimolar, 11 milisolar anestezik damlatın.

Damla içerisine 40 adet yetişkin hayvan seçin ve ardından lameli agros pedin üzerine ters çevirerek kapatın. Diğer tüm hatlar için işlemi tekrarlayın. Her bir hat için 30 hayvanı, her bir CEP ve D nöronunun varlığı açısından skorlayın.

FITC veya GFP'nin görüntülenmesine olanak tanıyan bir filtre küpüne sahip epi-floresan bir bileşik mikroskop kullanarak, verileri bir değerlendirme formuna kaydetmek için endo G-F-P-H-Y-Q filtre küpü kullanacağız. Yabani tip hayvanlar, tüm dört CEP nöronunda ve iki A DE nöronunda dersler için eksiksiz GFP korurlar. D nöronlarının kaybını gösteren tekil hayvanlar, bilinen yabani tip veya dejenerasyona uğramış olarak skorlanır.

Bu nöronlar LG veya GFP kaybı olarak kaydedilir. Benzer şekilde, her bir hayvanda kaybedilen toplam nöronların yanı sıra popülasyon sayımı ile dejenerasyon derecesi puanlanabilir; analiz her seferinde her hat için 30 ek hayvan kullanılarak iki kez daha tekrarlanır.

Üç analiz turundan elde edilen, vahşi tip dopamin nöronları sergileyen toplam solucan sayısı ortalaması alınır. Nöroproteksiyon için istatistiksel analiz, 0,05'ten küçük P değeri ile Student's T-testi kullanılarak gerçekleştirilir. Kontrol solucanlarını, dopamin nöronlarında aday genleri aşırı eksprese eden suşlarla karşılaştırmak için, yumurta aşamasından sonraki çeşitli günlerde bu analiz gerçekleştirilir; uygun analiz günleri ampirik olarak belirlenir.

Örneğin, alpha CLE artı GFP hayvanlarının sırasıyla gelişim sonrası altıncı, yedinci ve onuncu günlerde %77, %87 ve %90'ının dejenere olmuş dopamin nöronları sergilediğini belirledik. Bu nedenle, ilgili transgenin nörodejenerasyonu artırabileceğini öngörüyorsak, altıncı günde analiz yapacağız. Benzer şekilde, nörodejenerasyonu baskılayabilecek transgenler yedinci ve onuncu günlerde analiz edilecektir.

Size, C. elegans'ta dopamin nörodegenerasyon analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken şunları hatırlamanız önemlidir: birincisi, genetik çaprazlamalar sırasında seçim için uygun belirteç kullanın; ikincisi, çaprazlamalar için sağlıklı erkekleri ve L4 evresindeki hermafroditleri kullanın.

Ve üçincü olarak, CEP ve a DE nöronlarını dikkatli ve tutarlı bir şekilde skorladığınızdan emin olun. Bu prosedür, alpha alpha CLE kaynaklı nörodejenerasyonu artırabilecek veya baskılayabilecek genetik faktörleri hızla analiz etmenize olanak tanıyacaktır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.