Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Merhaba, ben MIT biyoloji bölümündeki Susan Linus Laboratuvarı'nda lisansüstü öğrencisi Randall Hoffman. Bugün sizlere yarı denatüre deterjan agaroz jel elektroforezini veya SDD-AGE'yi tanıtacağım. Laboratuvarımız bu tekniği, prionlar ve diğer amilojenik proteinleri taramak için kullanmaktadır.

Bizim SDD yaşlandırma versiyonumuz basit ve güvenilirdir; herhangi bir örnek sayısını karşılayacak şekilde ölçeklendirilebilir. Amiloidler, SDS ile denatürasyona karşı olağanüstü dirençlidir ve bu durum onların SDDH kullanılarak diğer proteinlerden ayrılmasını sağlar. Ancak, SDDH'den elde edilen veriler tek başına bir maddenin amiloid olduğunu doğrulamak için kullanılamaz.

Bunu yapmak için diğer teknikleri kullanmanız gerekir. Bunu göz önünde bulundurarak, size göstereyim. S-D-D-H-S-D-D-H, yatay DNA elektroforezi için kullanılan standart ekipmanlar ile gerçekleştirilebilir.

İlk olarak, jel döküm tepsisini monte etmeniz gerekir. Aparatın boyutu, kaç adet örneğiniz olduğuna bağlı olarak değişecektir. Çok sayıda örnek için, 20'ye 24 santimetrelik bir plaka ve dört adete kadar 50 kuyucuklu tarak kullanıyoruz.

Jeli hazırlamak için orta veya yüksek jel mukavemetli düşük EEO agroz, 1X TAE tamponu ve %10'luk SDS stok çözeltisine ihtiyacınız olacak. %1,5'luk bir agroz ve 1X TAE çözeltisi hazırlayın. En fazla örneği yükleyebilmek ve deteksiyonu maksimize etmek için jeli mümkün olduğunca kalın hazırlamanız gerekir. Agroz tamamen çözünene kadar karışımı mikrodalga fırında ısıtın.

100 XSDS stok çözeltisini hızla %0,1'e ekleyin ve karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın. Bu adım sırasında bazı agrar katılaşırsa, bir ısıtıcı tabla üzerinde çözün. Kaynamamasına dikkat edin.

SDS eklendikten sonra çözelti kolayca köpüreceği için, bu çözeltiyi henüz sıcakken döküm tepsisine boşaltın. Daha sonra, jel transferi sırasında ileride sorun oluşturabilecek hava kabarcıklarını gidermek için bir tarak kullanın. Jel tamamen soğuyup katılaştıktan sonra, tarakları dikkatlice çıkarın ve jeli tankın içine yerleştirin.

Jeli, %0.1 SDS içeren 1X TAE çözeltisine tamamen daldırın. Artık örneklerinizi yüklemeye hazırsınız. SDDH'de kullanılan protein örnekleri, iki önemli istisna dışında tıpkı bir SDS-PAGE'deki gibi hazırlanır.

İlk olarak, agregatların protein monomerlerine denatüre olmasına neden olabilecek ısıtma işlemlerinden kaçınmalısınız. İkinci olarak, protein degradasyonunu önlemeye dikkat edin. Burada kullanılan denatüre edici koşullar tüm proteazları inaktive etmek için yeterli olmadığından, önerilen konsantrasyonun en az iki katı oranında komple bir proteaz inhibitör kokteyli kullanmanızı öneririz.

Bu gösterimde, ilgilenilen belirli bir proteini aşırı eksprese eden maya hücrelerinden elde edilen lizatları kullanacağız. Genellikle VWR'den temin edilebilen 96 kuyucuklu bloklarda büyütülen 2 mL gece boyu kültürler kullanırız; ancak düşük bolluktaki proteinler analiz edilirken daha büyük kültür hacimleri kullanılmalıdır.

Kültürü oda sıcaklığında 2000 RCF'de beş dakika santrifüjleyerek hücreleri hasat edin; santrifüj işleminin ardından üst fazı uzaklaştırın ve hücreleri suda yeniden süspanse edip tekrar santrifüjleyerek yıkayın. İkinci çevirme işleminden sonra üst fazı uzaklaştırın ve hücreleri uygun plaka solüsyonunda yeniden süspanse edin. Solüsyondaki enzimler, hücrelerin küçük bir lizis tamponu hacmiyle verimli bir şekilde lizize edilmesini sağlayacak şekilde hücre duvarlarını sindirecektir. 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Yedek plastik hücreleri bu kez 800 RCF'de beş dakika boyunca pelletleyin. Üst fazı tamamen uzaklaştırın ve her bir pelleti 100 µL lizis tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, bloğun üzerini bantla kapatın ve yüksek hızda iki dakika boyunca vorteksleyin.

Bu işlem, tüm küresel plastiklerin hücresel kalıntıları 4,000 RCF'de, iki dakika boyunca çöktürmesine yardımcı olur. Süpernatantı dikkatlice 96 kuyucuklu bir PCR plakasına aktarın.

Laboratuvarımızda genellikle aynı anda yüzlerce örneği analiz ettiğimiz için bu süreçte bize yardımcı olması amacıyla bir sıvı taşıma sistemi kullanıyoruz. İstenirse, lizatların protein konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, bir x örnek tamponu içeren lizatlar oluşturmak için örneklere dört x örnek tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Şimdi örnekleri jelle yükleyin. İstenirse, örneklerin yarısı SDS page analizi için saklanabilir. Ayrıca, önceden boyanmış markerlar ve tavuk flector s ekstraktı gibi çok yüksek moleküler ağırlıklı bir marker dahil olmak üzere moleküler ağırlık markerlarını yükleyin.

Arzu edilirse, düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin difüzyonunu önlemek için jeli soğuk tutmak önemlidir, bu nedenle işlemi soğuk odada gerçekleştirmek isteyebilirsiniz. Jeli, jel uzunluğunun santimetresi başına üç volttan daha düşük bir düşük voltajda çalıştırın. Boya cephesi jelin sonuna yaklaşık bir santimetre kalana kadar jeli birkaç saat boyunca çalıştırın.

Amyloid, oda sıcaklığında %2 SDS ile denatüre olmadığı için, çoğu non-amyloid agregat dahil olmak üzere diğer kompleksler %2 SDS varlığında ayrışırken amyloid yapısı bozulmadan kalacaktır. Bu nedenle, çoğu protein monomerik halde olacak ve jel boyunca hızla ilerleyecektir. SDS'ye dirençli yüksek moleküler ağırlıklı amyloidler ise daha yavaş göç edecektir.

Bunun ardından jel, aktarıma hazır hale gelecektir. Birden fazla aktarım yöntemi kullanılabilse de, en iyi sonuçları kapiler aktarım kullanarak elde etmekteyiz. Kapiler aktarım her boyut jellle uyumlu olduğundan, kapiler aktarımda yüzlerce örneği analiz etmek pratiktir.

Kuru blotting kağıtlarından oluşan bir yığın, tampon çözeltiyi jel üzerinden çekerek proteinlerin, kağıtlar ile jel arasına yerleştirilen bir nitroselüloz membrana çökelmesini sağlar. Yüksek bağlayıcı C ekstra gibi bir nitroselüloz parçasını, jelin boyutlarıyla aynı olacak şekilde kesmeniz gerekecektir. Ayrıca, jelle aynı boyutta 20 adet GBO 04 ve 8 adet GBO 02 blotting kağıdı kesmeniz gerekecektir.

GB04 oldukça kalın ve emicidir. GB02 ise çok daha ince ve daha hassas bir dokuya sahiptir, bu da membranla daha eşit bir temas sağlanmasına yardımcı olur. Fitil olarak kullanılmak üzere ek bir GB04 parçası kesin ve bunu, daldırılan jelden yaklaşık 20 santimetre daha geniş olacak şekilde hazırlayın.

Nitroz UL WIC, dört adet GBO o2 ve bir adet XTBS plastik bir kapta şu şekilde üst üste dizilir: 20 adet kuru GBO o4, ardından dört adet kuru GBO o2 ve son olarak bir adet önceden ıslatılmış GBO o2.

Nitrocellulose membranı bu yığının üzerine yerleştirin. Fazla koşma tamponunu uzaklaştırmak için döküm tepsisindeki jeli kısaca suyla durulayın. Ardından, gerektiğinde membranı TBS ile nemlendirerek, jeli dikkatle tepside kaydırıp yığının üzerine aktarmaya başlayın.

Ekstra tampon, kabarcıkların jel içinde hapsolmasını önlemeye yardımcı olur. Jel tamamen yığına taşındıktan sonra, transfer pipeti bu amaç için etkili bir şekilde çalışır. Varsa kabarcıkların olup olmadığını dikkatlice kontrol edin.

Kabarcıklar giderilebilene kadar jel kenarını kaldırıp tampon çözeltiyi yeniden uygulayın. Önceden ıslatılmış kalan üç GBO parçayı jelin üzerine yerleştirin. Bir pipeti yığının üst kısmı boyunca sıkıca yuvarlayarak tüm katmanlar arasında tam temas sağlandığından emin olun.

Transfer diziliminin yanlarına TBS içeren iki yükseltilmiş tepsi yerleştirin ve önceden ıslatılmış fitili, her iki ucu da sıvıya batacak şekilde dizilimin üzerine yayın. Birleştirilmiş transfer dizilimini, üzerine 500 ml'lik bir su şişesi gibi ek ağırlık konulmuş ek bir plastik tepsi ile TBS içinde kapatın. Fitil, tepsilerdeki tamponu çekecek ve kuru blot kağıtları, birkaç saatlik süre boyunca tamponun jel boyunca ilerlemesini sağlayacaktır.

Bu işlem proteinlerin membrana çökelmesini sağlayacaktır; transferin en az üç saat veya gece boyunca devam etmesine izin verin. Kapiler transfer tamamlandıktan sonra, membran standart western blotting ile işlenebilir. Burada, belirli proteinlerin amiloid oluşturmasına yatkınlık sağlayan bir maya suşunda aşırı eksprese edilen proteinlerin tipik bir blot görüntüsünü görüyorsunuz.

Burada ve burada gösterilenler gibi bazı adaylarımızın amiloid veya yüksek moleküler ağırlıklı SDS'ye dirençli türleri çok iyi oluşturduğunu açıkça görebilirsiniz. Öte yandan diğerleri, şunlarda ve şunlarda olduğu gibi, agregat oluşturmazlar ve tamamen monomerik yapıdadırlar. Ayrıca, bu iki şeritte görebileceğiniz üzere, amiloid polimerlerin boyutunun proteine bağlı olarak farklılık gösterdiğini görebilirsiniz.

Sizlere, aday prionların amiloidleri gibi yüksek moleküler ağırlıklı, çözünmeyen agregatların analizi için basit bir yöntem gösterdik. Sunumumuzu izlemekten keyif aldığınızı umuyor, bu tekniği immünojenik protein çalışmalarında faydalı bulmanızı diliyoruz. İzlediğiniz için teşekkür eder, araştırmalarınızda başarılar dileriz.