Thymus Kültürler Reaggregate

Merhaba, ben Andrea White. Birmingham Üniversitesi'ndeki MRC İmmün Düzenleme Merkezi'nde Graham Anderson ve Eric Jenkinson'ın laboratuvarındayım. Bugün, T-hücresi diferansiyasyonu sırasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek, yeniden agregat edilmiş timik organ kültürlerinin türetilmesine yönelik bir protokol sunuyorum. Bu prosedüre başlanmadan önce, embriyonik timik loblar izole edilmiş ve tüm lenfositleri uzaklaştırmak için işlenmiştir.

Bu, ayrı bir videoda görülebilir. Daha sonra, stromal hücre hazırlığı oluşturmak için alienoid loblar ayrıştırılır. Ve son olarak, hücreler yeniden birleştirilerek bir re-aggregate fmic organ kültürü oluşturulur.

Başlayalım. Kültürde beş ila yedi gün geçtikten sonra, LO, shoal hücre preparatları için disagrege edilmeye hazır olmalıdır; 0,8 µm filtreleri, RPMI 1640 artı %10 FCS içeren bir Petri kabına batırın. Pens yardımıyla, kendiliğinden ayrılıp yüzmeyen fiber kalıntılarını nazikçe iterek temizleyin. Lobları 1,5 mL'lik bir endotür tüpe aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın.

Her Eppendorf tüpü başına en fazla 50 lob öneriyoruz. Lobların yer çekimi altında tüpün tabanına çökmesini bekleyin ve ardından ortamı uzaklaştırın. Lobları 1 ml PBS ile yıkayın ve ardından lobların tekrar tabana çökmesini sağlayın.

Bu işlemi toplam üç kez PBS yıkaması yapana kadar tekrarlayın, son PBS yıkamasını uzaklaştırın ve 600 µL %0,25'lik tripsin çözeltisi ekleyin. Eppendorf tüpünü 37 °C'lik bir inkübatöre 25 dakika boyunca yerleştirin. Bir pipet yardımıyla 1 ml'lik mavi uç kullanarak lobları 10 saniye boyunca nazikçe trite edin ve ardından tekrar inkübatöre yerleştirin; 20 dakika sonra lobları tamamen ayrıştırmak için pipetle yukarı aşağı çekin.

Tek hücre süspansiyonu elde etmek için, tripsini nötralize etmek amacıyla 400 microliters buz gibi soğuk, %10 FCS eklenmiş RPMI 1640 ekleyin; hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca bin RPM'de santrifüj ederek çökelttirin, süpernatantı uzaklaştırın ve gerekirse pelletini 1 mil. %10 FCS eklenmiş RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın. Bu işlem yaklaşık 30 saniye sürmelidir.

Genellikle, E 15 fibröz dokusundan başlayarak, her dioksazin lobu başına yaklaşık 50, 000 hücre bekleriz. Şimdi, bir buçuk mililitrelik eppendorf tüpünde agregat fmic Corgan kültürleri oluşturmaya hazırız. Taze hazırlanmış stromal hücreleri karıştırın.

Önceden seçilmiş CD4 pozitif CD8 pozitif fibrositler ile birlikte. Stromal hücrelerin fibrositlerle yaklaşık olarak birer bir oranında olmasını öneririz. Kullanacağınız hücre sayısı, mevcut hücre sayısına ve gerçekleştirilecek deneylere bağlı olarak değişecektir.

Toplamda en az yüz bin ve 1,5 milyon hücreden fazla olmamasını öneririz. V agregatlarının tekrarlanabilir olacak kadar büyük, ancak merkezinin ölmeyeceği kadar küçük olmasını istersiniz. Hücreleri 4 °C'de, 10 dakika boyunca bin RPM'de santrifüj ederek çöktürün. Organ kültürü filtresini dikkatlice monte edin.

Süpernatantın tamamını P 200 pipet kullanarak uzaklaştırın. Hücre pelletini, bir süspansiyon oluşturmak için 10 saniye boyunca vorteksleyin. Hacim yaklaşık olarak bir ila iki mikrolitre olmalıdır.

Süspansiyonu, hücre süspansiyonunu pipet ucunda tutarak ince uçlu bir pipete çekin. Diseksiyon mikroskobu altında, hücre süspansiyonunu dikkatlice 0,8 µm'lik bir filtrenin merkezine pipetleyin. İdeal olarak hücreler, bir ila iki milimetre çapındaki bir daire içerisinde dik bir damla şeklinde yerleştirilmelidir.

Eğer bulamaç yayılmaya başlarsa, kalan hücreleri yerleştirmeden önce bulamaçtaki sıvının pos üzerinden süzülmesine izin verin. Kabı plastik bir saklama kabına yerleştirin ve kapatın. Timus organ kültürlerinde olduğu gibi, kabı bir inkübatöre yerleştirin; agrege kültürler kültürün 18 saati içinde sağlam yapılar oluşturur.

Dört ila beş günlük kültürden sonra, hem CD4 pozitif CD8 negatif hem de CD4 negatif CD8 pozitif olgun sit subsetleri oluşturacaklardır. 50 dioxazine ilele işlenmiş loblarla başlamak, üç ila beş reaggregate kültürü hazırlamak için yeterli stromal hücreyi sağlamalıdır. Bu kültürler tipik olarak, bozulmadan forseps yardımıyla filtrelerden itilebilen koherent hücre kümeleri şeklinde görünür.

F epitelyal hücreleri tarafından gerçekleştirilen pozitif seçilimin incelenme yöntemini açıklamış bulunmaktayız. Bu yöntem, dendritik hücre aracılı negatif seçilimin incelenmesi için de kullanılabilir. Son olarak, TCR transgenik FİBROSİTLER veya MHC Sınıf I eksik veya MHC Sınıf II eksik stromal hücreler kullanılarak çalışılabilir.

Bu sistem, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T hücresi seçiliminin ayrı ayrı incelenmesine olanak tanır. İzlediğiniz için teşekkürler.