İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

İnsan beynindeki nöron spesifik gen ekspresyonunu yöneten kromatin DNA etkileşimlerini incelemek için, öncelikle saf bir nöronal çekirdek popülasyonu elde edilmelidir. Postmortem insan beyin dokusu homojenize edilir ve toplam çekirdekler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu kullanılarak izole edilir. Ardından, çekirdekler nöron spesifik antikorlarla işaretlenir, akış metrik ayıklama (flow metric sorting) yoluyla izole edilir ve son olarak ultrasantrifüjasyon ile konsantre edilir.

Merhaba, ben Massachusetts Tıp Üniversitesi Psikiyatri Bölümü'nde Dr. Sharon McBarian'ın laboratuvarından Anish Matan. Bugün size postmortem insan beyin dokusundan nöronal çekirdek izolasyonu prosedürünü göstereceğim. Haydi başlayalım.

Sıralanacak her çekirdek örneği için, bin miligram dondurulmuş postmortal beyin dokusuyla başlayın. Bu miktarla, floresan aktifleştirilmiş sıralama sonrası yaklaşık 5 milyon nöronal çekirdek elde edebilirsiniz. Çekirdek ekstraksiyonuna başlamak için, beş ml lizis tamponu içeren bir dövme tüpüne 250 miligram beyin dokusu yerleştirin ve buz üzerine koyun.

Doku çözüldüğünde, buz üzerinde bir dakika boyunca homojenize edin. Homojenizasyon işleminden sonra, homojenize edilmiş dokuyu 15 ml'lik şeffaf bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından tüpü buza yerleştirin. Kalan dokular için bu homojenizasyon işlemini tekrarlayın.

Ardından, homojenize edilmiş doku solüsyonu sükroz solüsyonunun üzerinde kalacak şekilde bir konsantrasyon gradyanı oluşturmak için, ultrasantrifüj tüplerinin dibine dikkatlice 9 mL sükroz solüsyonu pipetleyin. Şimdi, ultrasantrifüjleme sırasında dengeli olduklarından emin olmak için ultrasantrifüj tüplerini tartın. Üst tabakaya lizis tamponu ekleyerek ağırlıkta gerekli düzenlemeleri yapın. Tüpler tartıldıktan sonra, onları SW 28 rotorlu ultrasantrifüje yerleştirin ve örnekleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 107163,6 RCF'de ultrasantrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, supernatantı ve konsantrasyon gradyanında bulunan debris tabakasını aspire ederek alın. Tüpün dibinde yer alan ve çekirdekleri içeren peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Ardından, her pelete 500 µL 1X PBS ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

20 dakika sonra, peletleri pipetleme yaparak yeniden süspanse edin. Buz üzerinde inkübasyon, peletlerin kendi başlarına biraz çözünmesini sağlayarak çekirdeklerin yeniden süspansiyonunu kolaylaştırır ve böylece çekirdeklerin maruz kaldığı stresi azaltır. Ardından, yeniden süspanse edilen çekirdekleri iki mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.

İki adet ultra santrifüj tüpündeki nükleik asit çözeltisini her bir mikrosantrifüj tüpüne birleştirin ve örnekleri tekrar buza yerleştirin. Nükleik asit ekstraksiyonu tamamlandığına göre, nöronal çekirdekleri izole etmek amacıyla immün boyama adımına geçeceğim; aslında, çekirdek içeren örneği içeren örnek, primer ve sekonder antikorların yanı sıra bloklama karışımlarından oluşan bir immün boyama karışımı ile inkübe edilecektir. İmmün boyama karışımını hazırlamak için 300 µL 1X PBS'e 1,2 µL nöron spesifik NeuN antikoru ekleyin. Ardından, 1X PBS içinde %0,5 BSA ve %10 normal keçi serumu içeren 100 µL bloklama karışımı ekleyin.

Son olarak, LOR 4 88 adlı sekonder antikorun bir mikrolitresini ekleyin. Ayrıca, bu immün boyama karışımı için negatif kontrol örneği için bir immün boyama hazırlayın. Primer antikoru çıkarın ve yerine 1,2 mikrolitre 1X PBS ekleyin.

Şimdi, boyama karışımları inkübe olurken, immün boyama karışımlarını vorteksleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta beş dakika boyunca inkübe edin. Negatif kontrol örneği için kontrol çekirdek örneklerini hazırlayın; süspanse edilmiş çekirdeklerden 20 µL'yi, 980 µL 1X PBS içeren iki ml'lik bir tüpe ekleyin. Ayrıca, yalnızca çekirdek solüsyonu ve PBS içeren boyanmamış bir kontrol hazırlayın.

Şimdi çekirdeklerden 20 µL'yi başka bir tüpe aktarın ve hacmi 1X PBS ile tekrar 1 mL'ye tamamlayın. Ardından tüm örnekleri tekrar buza yerleştirin. Bu aşamada immün boyama karışımları hazırlanmış olacaktır.

İnkübasyon için, uygun örneğe 401 µL karışım ekleyin. Çekirdek örneğine, hem yeni hem de LOR 4 88 içeren karışım eklenmiştir. Negatif kontrol örneğine sadece sekonder antikor LOR 4 88 içeren bir karışım eklenirken, boyanmamış kontrol örneğine hiçbir immün boyama eklenmemiştir.

Ardından, örnekleri soğuk rotatöre aktarın ve karanlıkta 45 dakika boyunca döndürün. 45 dakikalık inkübasyon tamamlandığında, floresanla aktive edilmiş ayırma işlemi gerçekleştirmek üzere örnekleri Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi akış sitometrisi merkez tesisine götüreceğim. Merkez tesisine nakil sırasında örnekler buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır. Akış sitometrisi merkez tesisinde örnekler önce 40 mikronluk bir filtreden geçirilir ve ardından soğuk tutularak birkaç dakika boyunca cihazdan geçirilir.

Bu işlem, sıralama öncesinde bazı ön veriler elde etmek amacıyla yapılır. Boyanmamış kontrol grubu, negatif floresan düzeyini belirler. Bu bilgiye dayanarak, cihazın floresan hassasiyetini ayarlayın.

Boyanmış kontrol, floresans kontrolü amacıyla kullanılır. Bu noktada, floresans kaynaklı herhangi bir arka plan gürültüsüne göre ayıklama için gerekli olan uygun kapılar (gates) belirlenir. Örnekleri ayıklamak için birkaç farklı kapı kullanılır.

İşte ilk kapı (gate) için bazı tipik veriler. Bu faks analiz şeması, kapı ayarlandıktan sonraki temsili bir örneği göstermektedir. İlk kapı, floresan ve genel görsel deneyim gibi ayarların kombinasyonuna dayanarak döküntü ve canlı çekirdek kalıplarını tanımlar.

X ekseni, göreceli boyutu temsil eden ileri saçılımı (forward scatter) gösterirken, Y ekseni granülarite gibi dahili karmaşıklığı temsil eden yan saçılımı (side scatter) gösterir. İlk kapı (gate), örneğimizde bulunan farklı çekirdeklerin boyutları hakkında da fikir verebilir. Bu durum, debrislerin gerçek çekirdeklerden ayrılmasını sağlar; işte ikinci kapıdan elde edilen bazı tipik veriler.

Bu faks grafiği, agregatları ayıklarken çekirdeklerin tek tek sıralanmasına olanak tanıyan ikinci bir kapı örneğini göstermektedir. Bu kapı, çekirdeklerin lazerden geçiş süreleri arasındaki farkları inceler. Agregat olanlar normalde geçiş için daha uzun süre harcar.

Bazı floresan çekirdekler floresan olmayanlara bağlanabildiği için, agregatların dahil edilmesi saflığı etkileyebilir; bu nedenle bu özel parametre oldukça önemlidir. Son olarak, işte üçüncü kapıdan (gate) elde edilen tipik veriler. Bu kapı, sekonder antikorumuzda bulunan florofora karşılık gelen belirli bir floresans dalga boyuna ayarlanmıştır.

Bu faks grafiğinde, x ekseninde floresan seviyesini ve Y ekseninde derin kırmızı kanal dedektörü PECY seven'ı görüyorsunuz. Bu nokta blotlar, tek renkli bir histogramla karşılaştırıldığında daha iyi bir görsel sunar. SCADA'nın yerleştirilmesi, yeni ve pozitif nöronal çekirdeklerin, yeni ve negatif nöronal olmayan çekirdeklerden ayrılmasına ve sınıflandırılmasına olanak tanır.

Tüm kapılar seçildikten sonra, çekirdekler tek bir XPBS içine sıralanır. Tüm numune sıralama işleminden geçtikten sonra, sıralanmış numunenin bir Eloqua analizini cihazda çalıştırarak sıralamanın saflığını kontrol edin. İşte optimal bir sonucun örneği.

Burada, çekirdeklerin karışık bir popülasyonunu içeren ayıklama öncesi örnek ile negatif çekirdeklerin çoğunun elendiği ayıklanmış Eloqua örneğini karşılaştırın. Saflık yüzdelerinin, belirlenen kapılara (gate) göre örneğe bulaşan olay sayısına dayandığını unutmayın. Örnek makineden ilk kez geçirildiğinde bir miktar solma (bleaching) meydana gelebileceğini ve bunun sonucunda bazı sönükleşmeler oluşabileceğini göz önünde bulundurun; bunu telafi etmek için bazı ayarlamalar yapılması gerekebilir.

Numune ayrıştırma işlemi tamamlandıktan sonra çekirdeklerin işlenmesine geçin. Bunun için, ayrıştırılmış numuneden 10 µL alın ve üzerine iki µL sakkaroz çözeltisi, 50 µL 1 M kalsiyum klorür ve 30 µL 1 M magnezyum asetat ekleyin. Eğer ayrıştırılmış numune 10 µL'den az ise, 1XPBS ekleyerek hacmi 10 µL'ye tamamlayın veya eklenen diğer malzemelerin miktarlarını buna göre ayarlayın.

Ardından, örneği birkaç kez altüst edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. 15 dakika sonra, örneği sallanan kova rotorunda (swing bucket rotor), 4 °C'de 1.786 RCF ile 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, tüpün dibinde bulunan beyaz peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Ardından, pellet'i önceki deneyler için gerekli olan uygun çözeltinin 200 microliters hacmindeki kısmında çözün. Bu durumda, sonraki çip deneyi için pellet'i çözme tamponuyla çözüyoruz. Sonrasında, pellet'i pipetle aşağı yukarı çekerek süspande edin.

Bu noktada, çekirdekleri daha küçük bir tüpe aktarabilir ve -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirebilirsiniz. Bir sonraki kullanıma kadar saklayabilirsiniz. Böylece, insan postmortem beyin dokusundan nöronal çekirdeklerin nasıl izole edileceğini göstermiş oldum. Bu çekirdeklerle, kromatin immünopresipitasyon gibi bir dizi farklı analiz gerçekleştirebilirsiniz.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, çekirdeklerin fikse edilmemiş olması ve yüksek sıcaklıklarda bozunabilmesi nedeniyle örneklerinizi her zaman buz üzerinde tutmayı hatırlamanız önemlidir. Ayrıca, insan dokusunun biyogüvenlik seviyesi iki veya daha yüksek güvenlik standartlarında işlenmesi önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.