Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi
2 Şubat 2009
Bu video tüm montaj immünhistokimya, bir antijen mekansal ve zamansal ifade desenini genç civciv embriyolarında görüntülendi edilebilecek bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından piyasaya sürüldü.
Bu video, HRP konjugasyonlu sekonder antikorlar kullanılarak civciv embriyosunda yapılan tüm mount immünohistokimya yönteminin farklı adımlarını göstermektedir. İlk olarak embriyo, paraformaldehit ile fikse edilir. Ardından endojen peroksidaz aktivitesi söndürülür.
Embriyo daha sonra primer antikor içinde inkübe edilir. Birkaç yıkama işleminin ardından, embriyo HRP konjugeli sekonder antikor içinde inkübe edilir. DAB substratı kullanılarak renk reaksiyonu ortaya çıkarılır ve antikor boyaması turuncu görünür. Bu yöntemin floresan antikorların kullanımına göre avantajı, embriyoların parafin kesit için işlenebilmesi ve böylece antijen bölgelerinin enine kesitlerde incelenebilmesidir.
Merhaba, ben Houston'daki Texas A&M'de bulunan Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki FIN Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün size, HRP konjuge antikorlar kullanarak tavuk embriyolarında hormon montaj antikor boyamalarının gerçekleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, antiepileptik ilaçlarla tedavi sonrası embriyoların morfolojisini incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse, civciv embriyolarında tüm monta immünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için başlayalım. İlk olarak, kabuğu pensle hafifçe vurarak ve kabuk parçalarını temizleyerek yumurtayı açın. Kalın albümini pensle alın ve embriyo yukarı bakacak şekilde vitellus kesesini kaba pensle eğin.
Ardından, embriyonun etrafındaki vitellüs kesesini kesmek için ince makaslar kullanın. Embriyoyu bir kaşıkla vitellüsten çıkarın ve bir disseksiyon mikroskobu altında PBS içeren bir kaba yerleştirin. Vitellüs içindeki membranları dikkatlice temizleyin ve embriyoyu PBS içeren taze bir kaba aktarın.
Embriyoyu aktardıktan sonra, embriyoyu pens ve entomolojik iğnelerle sabitleyin ve PBS'yi aspire edin. Bunun yerine PBS içinde %4 PFA ekleyin ve potansiyel mikrobiyal kontaminasyonu minimize etmek için embriyoyu oda sıcaklığında bir saat boyunca sabitlemeye bırakın. Embriyo sabitlendikten sonraki tüm adımlarda deiyonize H2O kullanın; sabitleyici solüsyonu aspire edin ve kimyasal atık olarak uygun şekilde bertaraf edin.
Kabı BS ile doldurun. Ardından, mikrodissection bıçağı kullanarak embriyonun etrafında bir kare şeklinde kesik atarak ekstra embriyonik membranları uzaklaştırın. Pinler çıkarıldıktan sonra, insekt pinlerini penset ile alın. Embriyoyu PBT içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için küt uçlu bir pastör pipeti kullanın.
Embriyoyu PBT ile üç kez, her biri 10 dakika olacak şekilde yıkayın. Sintélasyon tüpündeki PBT'yi uzaklaştırın ve potansiyel endojen peroksidazı inaktive etmek için yerine %0,3 H₂O₂ içeren PBTX ekleyin. Bir çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.
Embriyoyu önce üç kez 10 dakika boyunca, ardından üç kez 30 dakika boyunca PBT ile yıkayın. Embriyoyu antikorla boyamak için, öncelikle embriyoyu bir saat boyunca bloklama tamponu veya %1 BSA %1 NGS içinde yıkayarak başlayın.
Sekonder antikor keçide üretildiği için NGS kullanıyoruz. İnkübasyondan sonra mutatör üzerinde oda sıcaklığında bir saat bekletin, primer antikoru bloklama tamponunda bire bir oranında seyreltin ve embriyoyu bu solüsyonda dört derece santigrat sıcaklıkta iki gün boyunca inkübe edin. Mutatör üzerinde.
Primer antikor dilüsyon faktörü, seçilen primer antikora bağlıdır. Burada, süpernatant olarak sağlanan, gelişimsel çalışmalar hibrid DOMA bankasından bir antikor kullanıyoruz. Bunu bloklama tamponu ile bire bir oranında dilüye ediyoruz.
Ardından, PBT ile üç kez 10 dakika boyunca yıkama yapın ve bunu PBT ile üç kez birer saatlik yıkamalarla takip edin. Yıkama işleminden sonra, sekonder antikoru bloklama tamponu ile 1:2.500 oranında seyreltin. Bu örnekte peroksidaz konjuge keçi anti-US IgG kullanın ve embriyoyu bu çözelti içinde, çalkalayıcı üzerinde, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkube edin.
Boyalı embriyonun renk reaksiyonunu geliştirmek için PBT ile üç kez 10 dakikalık yıkama, ardından PBT ile üç kez bir saatlik yıkama gerçekleştirin. İlk iki yıkamayı 100 millimolar tris, HCL pH 7.4 içeren tris tamponu ile 20 dakika boyunca yapın. Ardından, embriyonun bulunduğu şişedeki son TS tamponu yıkamasını uzaklaştırın ve yerine beş mililitre DAB çözeltisi ekleyin.
Mutatörde 20 dakika boyunca karanlıkta bekletin. Einor ucunu %10'luk çamaşır suyu çözeltisi içeren kovaya atarak imha edin. DAB'ı dekontamine etmek için 16 µL ekleyin.
H 2 0 2 stok çözeltisini DAB içindeki embriyoların bulunduğu şişeye ekleyin. Karanlıkta bekletin. 10 dakika sonra, renk reaksiyonu tamamlandığında reaksiyonu mikroskop altında izleyin. DAB'ı çamaşır suyu kovasına dökün ve yerine beş mililitre ekleyin.
Musluk suyu. Ardından, fotoğraf çekimi ve mum kesit hazırlığı için PBS ile iki kez 10 dakikalık yıkama yapın. Boyanmış embriyoyu %25, %50, %75 ve %100'lük etanol serilerinde, her birinde 10 dakika boyuncale dehidre edin.
Dehidrasyon sonrası, etanolü 0,5 ile 1 ml sedir ağacı yağı ile değiştirin. Bu işlem, sedir ağacı yağı içinde fotoğraf çekimi için embriyoyu yarı saydam hale getirecektir. Fotoğraf çekiminin ardından embriyoyu tüpe geri koyun ve sedir ağacı yağını %100 etanol ile değiştirin.
Son olarak, etanolü %100 etanol içinde %5 fast green FCF ile değiştirin ve üç dakika boyunca inkübe edin. Bu adım, embriyoların histoloji için görünür olmasını sağlayacaktır. Fast green FCF çözeltisini %100 etanol ile değiştirin ve histoloji için işleme tabi tutun.
İşte boyanmış embriyolardan üç örnek. Bu evre 11 embriyoları, Jane Dod ve Tom Gessel'in laboratuvarında geliştirilen, nodal korda özgü bir antikor olan 15.3 B ile işaretlenmiş veya işaretlenmemiştir.
DAB içerisinde iki dakika geçtikten sonra embriyo hâlâ şeffaftır. DAB içerisinde 20 dakika geçtikten sonra, nodal korda hafif bir etiketleme görülür. Son olarak, 40 dakika sonra nodal kordun etiketlemesi tamamlanır.
Bu örnekte, Tom Jessel'in laboratuvarında geliştirilen bir antikor olan PAC seven'in, nöral tüp kapanmasının erken evrelerini ve orta beyinden çıkan kranial nöral krist hücrelerini nasıl tanıdığını gösteriyoruz. Burada embriyo, David Wilkinson'ın laboratuvarından alınan Croc 20 probu ile işaretlenmiş, ardından bir antikor uygulanmıştır. Size az önce, chick embriyolarında nasıl tüm bağışıklık histokimyası (whole mount immunohistochemistry) yapılacağını gösterdik.
Bu prosedür, daha önce bütün mount in situ hibridizasyon için işlenmiş embriyolarda da kullanılabilir. Bu durumda, in-situ hibridizasyonu takiben embriyoyu bir saat boyunca kısaca fiksle ve ardından antikor boyamasına geç. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, genç civciv embriyolarındaki antijenlerin mekansal ve zamansal ekspresyon modellerini görselleştirmek için kullanılan bir teknik olan tüm mount immünohistokimyayı göstermektedir. Yöntem, boyama sonuçlarını ortaya çıkarmak için fiksasyon ve antikor inkübasyonu dahil olmak üzere birkaç adım içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- İmmünohistokimya
Arka Plan
- Tüm vücut immünohistokimyası, embriyolarda antijen dağılımının incelenmesine olanak tanır.
- Bu teknik ilk olarak Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından tanıtılmıştır.
- Gelişimsel süreçler ve gen ekspresyonu hakkında bilgiler sağlar.
- HRP konjuge ikincil antikorlar, antijenlerin görselleştirilmesini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Bütünle bağışıklık boyama (whole mount immunohistochemistry) prosedürünü göstermek.
- Civciv embriyolarındaki antijen ekspresyonunu görselleştirmek.
- Bu yöntemin floresan antikor tekniklerine göre avantajlarını karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyoların paraformaldehit ile fiksasyonu.
- Endojen peroksidaz aktivitesinin sönümlenmesi.
- Primer ve sekonder antikorlar ile inkübasyon.
- Görselleştirme için DAB substratı kullanılarak renk reaksiyonunun ortaya çıkarılması.
Temel Sonuçlar
- Antikor boyaması turuncu görünür ve bu durum antijen tespitinin başarılı olduğunu gösterir.
- Embriyolar, boyama sonrası parafin kesit işlemi için hazırlanabilir.
- Bu yöntem, antijen bölgelerinin kesitsel çalışmalarına olanak tanır.
- HRP konjugatlı antikorların boyamadaki etkinliğini kanıtlar.
Sonuçlar
- Tüm mount immünohistokimya, civciv embriyolarının incelenmesi için değerli bir tekniktir.
- Antijen ekspresyon modellerinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
- Bu yöntem, sonraki histolojik analizler için avantajlıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Civciv embriyolarında bütün vücut immünohistokimyası, antijen ekspresyonunun mekânsal haritalanmasına olanak tanıyarak gelişimsel nörobilimde hedef doğrulamayı destekler. Bu yöntem, moleküler hedefleri hastalıkla ilgili bir sistemdeki fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltma sağlar. Parafin kesit alma ile uyumluluk, çapraz fonksiyonel ekiplerin immünohistokimyasal verileri histolojik analizlerle ilişkilendirmesine izin vererek preklinik hedef değerlendirmesinde translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gelişmekte olan nöral tüp ve somitteki antijen dağılımını görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Bozulmamış embriyolarda hedef etkileşiminin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Kurşun bileşik tanımlama için mekansal olarak çözümlenmiş ekspresyon verileri sağlayarak hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: HRP-konjuge ikincil antikorlar ve DAB substratı kullanarak standartlaştırılmış, tekrarlanabilir boyama paternleri oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Renk yoğunluğu aracılığıyla antijen bölgelerinin yarı kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak analiz optimizasyonunu destekler.
- Platformun Yeniden Kullanımı: Parafin kesitleme ile uyumludur ve aynı boyanmış örneğin birden fazla alt analitik iş akışına hizmet etmesine imkan tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlgisi: Antiepileptik ilaçlar gibi bileşiklerin embriyotoksik etkilerini bir omurgalı modelinde incelemek için uygundur.
- Translasyonel Süreklilik: Tüm mount ve kesit formatları boyunca tutarlı antijen takibine olanak sağlayarak keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen fenotiplerin, gelişmekte olan dokulardaki hedef modülasyonu ile korelasyon gösterip göstermediğini netleştirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uyum sağlayarak, öncü bileşik optimizasyonu öncesindeki erken hedef doğrulama ve analiz geliştirme aşamalarını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Gelişmekte olan beyin ve nöral tüpteki spasyotemporal antijen ekspresyonunu ortaya çıkararak hipotez testlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Embriyonik sistemlerde tekrarlanabilir bileşik değerlendirmesini destekleyen standardize immünohistokimyasal okumalar sağlar.
- Analitik: Aydınlık alan mikroskopisi ile tespit edilebilen kromojenik sinyal üretir ve durum karşılaştırması için kantitatif görüntü analizine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Antijen lokalizasyonunun hem bütün mount hem de histolojik kesitlerde valide edilmesine izin vererek biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gelişimsel toksisite veya hedef ekspresyonu çalışan birden fazla projede uygulanabilen, yeniden kullanılabilir, histolojiye uygun bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Antijen varlığını belirli embriyonik yapılarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış fiksasyon, bloklama ve antikor inkübasyon adımları aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonun histolojik onayını sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gelişimsel hedef etkileşim profillerine dayalı olarak bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Embriyo diseksiyonu, immünohistokimya ve kromojenik deteksiyon konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikroskoplara, mutatörlere ve DAB ile H2O2 kullanımı için havalandırma sistemlerine erişime bağlıdır.
- Antikor dilüsyonu ve yıkama protokollerinin ekipler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer türlere adaptasyon, geçirgenlik ve bloklama adımlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında daha uzun inkübasyon süreleri ve artefakt oluşumunu önlemek için DAB'ın dikkatli bir şekilde bertaraf edilmesi gerekliliği yer alır.
