تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

تبدأ هذه الإجراءات بالحصول على الكتلة الحيوية الميكروبية البحرية من عينات المياه عن طريق الترشيح المسبق عبر مرشحات بقياس 5 و3 ميكرومتر، يليه الجمع على مرشح بقياس 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك، يتم استخلاص الـ RNA الكلي من الكائنات المحتجزة على المرشح الذي قياسه 0.22 ميكرومتر. ثم يتم إزالة الـ RNA الخاص بنا من الـ RNA الكلي عن طريق التحلل الإنزيمي الانتقائي والتهجين الطرحي، ويتم تضخيم Mr.N المخصب خطياً عبر إضافة ذيل polyA والنسخ في المختبر.

يتم بعد ذلك تحويل الـ RNA المضاد للمعنى (antisense RNA) المُضخم إلى DNA مكمل (cDNA) مزدوج السلسلة باستخدام سداسيات عشوائية (random hexamer). ويمكن استنساخ الـ cDNA الناتج وتسلسله أو إخضاعه مباشرة لتسلسل البيروسيكوينسينغ (pyro sequencing). مرحباً، أنا ريتشل بيرسكي من مختبر الدكتورة ماريان موران في قسم علوم البحار بجامعة جورجيا.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لفحص التعبير الجيني في العينات البيئية، وذلك باستخدام علم الميتا-ترانسكريبتوميات البيئية. سيقوم سكوت جيفورد بتوضيح كيفية معالجة العينات البيئية لجمع الـ RNA.

سأوضح لكم كيفية استخلاص الـ RNA من العينات وتحديد قيم RINs. وسيقوم AON بشرح عملية إزالة الـ RNA. ثم ستنتقل Maria Kosta إلى خطوات تضخيم الـ RNA وتصنيع الـ CD NA.

دعونا نبدأ الآن. لبدء عملية جمع الحمض النووي الريبي (RNA) البيئي، نقوم بإعداد نظام خط الترشيح عن طريق وضع أحد طرفي الأنابيب في الماء عند العمق المطلوب لأخذ العينة، وتوصيل الطرف المقابل بمرشح عالي السعة بحجم 3 µm، مع وضع المضخة بين طرفي الأنابيب. بعد ذلك، يتم توصيل مرشح 3 µm ببرج ترشيح 0.22 µm، ويتم توجيه التدفق الخارج من برج 0.22 µm إلى وعاء مدرج.

مرّر عدة لترات من الماء عبر النظام للشطف. عند الانتهاء، قم بإزالة الأنابيب من الماء أثناء تشغيل المضخة لتفريغ الماء المتبقي من الخط. بعد ذلك، استخدم ملقطاً لوضع مرشح بمسامية 0.22 micrometer على برج الترشيح ثم أغلقه.

أعد طرف الخط إلى الماء وقم بتشغيل المضخة. اترك الهواء يخرج من كلا المرشحين وراقب حجم الماء المُرشح في القارورة. وبمجرد ترشيح الحجم المطلوب، أخرج الخط من الماء وقم بتفريغ الماء المتبقي من النظام.

بمجرد جفاف المرشح، قم بإزالة لوحة المرشح العلوية بسرعة واطوِ ورقة الترشيح. ضع المرشح في أنبوب whirl pack وقم بتجميده سريعاً في النيتروجين السائل. قبل البدء في التجربة، من المهم ملاحظة أنه نظراً لانتشار RNAs في كل مكان وتحلل mRNAs بسرعة، يجب اتباع الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من الريبونوكليز، بما في ذلك أسطح العمل والماصات.

ومع وضع ذلك في الاعتبار، يجب ارتداء قفازات نظيفة عند التعامل مع أي من المواد المستخدمة في هذا الإجراء. كما يجب معالجة العينات في أقصر وقت ممكن. لبدء استخلاص الـ RNA الكلي من مرشح 0.22 micrometer، نقوم بتجهيز أنابيب الخرز عن طريق إضافة 8 mL من محلول RLT buffer مع إضافة beta meto ethanol إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

ثم يتم إضافة واحد إلى اثنين من المليلترات من حبيبات RNA من طقم استخلاص التربة المتنقل. أخرج المرشح المجمد بسرعة من المجمد مع إبقائه في غلاف World Pack، ثم قم بتفتيته باستخدام مطرقة.

أضف المرشح المكسر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter مجهز، وأحكم إغلاق غطاء الأنبوب باستخدام شريط "parfum" أو شريط لاصق مختبري، ثم قم بالخلط الدوامي (vortex) لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للأنبوب سعة 50 milliliter بسرعة 5,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. وفي درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول التحلل (lysate) ونقله إلى أنبوب سعة 15 milliliter قبل إجراء الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق.

عند 5,000 ×g، يتم نقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter، ويضاف حجم واحد من 100% ethanol إلى المستخلص الخلوي. وباستخدام حقنة سعة 10 milliliter، اسحب المستخلص الخلوي عبر إبرة بقياس 18 إلى 21 gauge ثم ادفعه للخارج مرة أخرى نحو خمس مرات. وفي خطوات الاستخلاص اللاحقة، استخدم طقم KaiGen R and easy mini وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع تطبيق المستخلص الخلوي على العمود الموفر باستخدام المجمع الفراغي أو عن طريق الطرد المركزي المتكرر.

قم بقياس كمية الحمض النووي الرايبوزي (RNA) الكلي باستخدام القياس الطيفي. بعد تحديد حصيلة الـ RNA الكلية، نستخدم طقم Ambien turbo DNA free وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي ملوثات من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA). والآن بعد اكتمال عملية استخلاص الـ RNA، سأقوم بتسليم الـ RNA الكلي إلى يوهانا، التي ستقوم بخطوات إزالة الـ RRNA الأولى والثانية.

شكرًا يا راشيل. لبدء عملية إزالة RRNA، قم بخلط 10 times reaction buffer بلطف وطردها مركزيًا لفترة وجيزة قبل الاستخدام في أنبوب معقم خالٍ من RNA سعة 0.5 milliliter، ثم ادمج الأحجام المناسبة من 10 times reaction buffer وRNA inhibitor وعينة total RNA وterminator exonuclease. وفقًا لبروتوكول epicenter، قم بتحضين التفاعل عند 30 °C لمدة 60 دقيقة في جهاز thermocycler بغطاء مسخن أو في حمام مائي.

بعد ذلك، يتم إيقاف التفاعل عن طريق الترسيب باستخدام الفينول والإيثانول، وذلك بإضافة المياه الخالية من الـ RNases أولاً حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 200 µL، ثم إضافة حجم واحد من محلول الفينول والكلوروفورم بنسبة 1:1 إلى أنبوب طرد مركزي الـ mRNA. يتم جمع الطور المائي، ثم الترسيب باستخدام إيثانول بتركيز 100% وأملاح. وتعتبر هذه الخطوة نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين RNA عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين وقت استخدام العينة في التطبيقات اللاحقة. وبمجرد الانتهاء من الإثراء الأول لـ mRNA، سنستخدم طقمي Ambien microbe enrich وmicrobe express وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة أي RRNA متبقٍ من العينة. ولتسهيل إزالة RRNA حقيقيات النوى، سنستخدم طقم microbe enrich.

يتم تحديد جميع الأحجام من خلال قراءة تعليمات الشركة المصنعة. للبدء، اسحب 300 µL من منظم الربط (binding buffer) باستخدام الماصة وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 mL. أضف من 5 إلى 100 µg من إجمالي الـ RNA في حجم أقصى يبلغ 30 µL ثم استخدم جهاز الرج الميكانيكي (vortex).

أضف برفق 2 µL من خليط قليغو الالتقاط (capture oligo mix) المناسب لـ 5 µg من الـ RNA في محلول الربط (binding buffer)، ثم نقر الأنبوب برفق. قم بطرد الخليط مركزياً لفترة وجيزة. قم بمسخ الخليط عند 70 °C لمدة 10 دقائق، قبل تحضينه عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

أثناء هذه الحضانة، قم بتجهيز حبيبات mag oligo عن طريق غسلها مرة واحدة في ماء خالٍ من النوكلياز ومرة واحدة في محلول الربط (binding buffer)، مع تثبيت الحبيبات على حامل مغناطيسي بين عمليات الغسل. احفظ الحبيبات على الثلج ثم اتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. وقبل خمس دقائق من الاستخدام، قم بتسخين محلول الغسل إلى 37 °C في كتلة تسخين (heat block).

أضف مزيج قليلات النوكليوتيد (oligo mix) لالتقاط الـ RNA إلى حبيبات المغناطيس المغسولة، ثم امزج الأنبوب برفق وقم بتدويره باستخدام جهاز الطرد المركزي. حضن المزيج لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي وانتظر لمدة ثلاث دقائق تقريباً قبل سحب السائل العلوي الذي يحتوي على الـ mRNA ونقله إلى أنبوب تجميع على الثلج.

بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الغسيل المسخن مسبقاً إلى الخرزات التي تم التقاطها. ثم قم برج الخرزات بلطف باستخدام جهاز Vortex واسترجع السائل الطافي. انقل هذا السائل الطافي الذي يحتوي على mRNA إلى أنبوب التجميع على الثلج.

ضع أنبوب التجميع على الثلج أثناء التحضير لإزالة RRNA بدائية النواة باستخدام طقم ambi microbe express، والذي سنستخدمه لإزالة RRNA بدائية النواة المتبقية. استخدم جهاز bioanalyzer أو Experion للتحقق من تلوث RRNA وجودة MR.NA. وتعتبر هذه نقطة توقف محتملة.

يمكن تخزين RNA في درجة حرارة 80- درجة مئوية. وبمجرد إزالة RRNA، سنستخدم مجموعة Ambien message AMP two bacteria وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتضخيم mRNA الخاص بنا. والآن، بعد أن حصلنا على عينة نقية من mRNA، سأسلم التجربة إلى ماريا، التي ستصحبكم خلال عمليتي تضخيم mRNA وتخليق CDNA.

شكرًا لكِ يا هانا. قبل البدء في تضخيم الـ mRNA، قومي بحساب أحجام كل مكون من المزيج الرئيسي لمجموعة Ambien message AMP two bacteria عبر الإنترنت. نبدأ بعملية إضافة ذيل عديد الأدينيلات (polyadenylation) لـ RNA القالب من خلال وضع ما يصل إلى 1000 nanograms من الـ RNA الكلي في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وخالٍ من الـ RNA. استخدمي 6.5 µL من العينة ولا تضعي ماءً خاليًا من الـ RNA في المنظم الأول لتخليق RNA عبر النسخ في المختبر.

يُنصح باستخدام فرن تهجين أو حاضنة نظراً لتوزيعهما المنتظم للحرارة. وبسبب الأهمية البالغة لمنع تكون التكثيف داخل الأنابيب، نوصي بشدة بفترة حضانة مدتها 14 ساعة لتفاعل النسخ المختبري (in vitro transcription). ولتحقيق أقصى عائد من الـ RNA وللحصول على أعلى عائد من الـ A RNA، يتم إجراء عملية الـ IBT في حجم تفاعل نهائي قدره 40 µL، ويُحفظ الـ A RNA في درجة حرارة -80 °C في حصص تبلغ تقريباً 10 µL.

بمجرد تضخيم الـ RNA، يحين وقت تخليق الحمض النووي المتمم أو الـ cDNA. يُستخدم طقم نظام تخليق الـ cDNA من Promega universal ribot Clone لتخليق الـ cDNA من الـ RNA. يوفر الطقم تعليمات لتحويل 2 µg من الـ RNA إلى cDNA. ونوصي باستخدام كمية تتراوح بين 6 إلى 10 µg من الـ RNA وتعديل حجم التفاعلات وفقاً لذلك.

قم بتنقية الـ CD NA إما باستخدام الترسيب بالإيثانول أو نظام Promega Wizard DNA cleanup. ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، تُحفظ العينات عند درجة حرارة 80- °C. يمكن في هذه المرحلة إجراء التسلسل المباشر للـ double stranded CDNA. من 10 liters من مياه البحر، استخلصنا ما يقرب من 10 micrograms من الـ environmental RNA وقمنا بتضخيمه بمقدار 20 ضعفاً؛ ومن خلال تحويل الـ amplified MR.NA إلى double stranded CDNA، تم إنتاج كميات كافية من المادة اللازمة لتسلسل وتحليل النسخ البيئية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تقييم التعبير الجيني للمجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام الـ environmental meta transcriptomics.

تذكر دائماً عند تنفيذ هذا الإجراء أن mRNA يتحلل بسرعة وأن RNAs منتشرة في كل مكان. لذا، اتخذ الاحتياطات القياسية للعمل في بيئة خالية من الـ ribonuclease وقم بمعالجة العينات بأسرع ما يمكن. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.