التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

مرحباً، اسمي إينا، ونقوم بشكل روتيني بإجراء تحليل ملفات التعبير الجيني في المختبر. ونستخدم هذه التقنية لمراقبة الجينات ذات التنظيم التفاضلي بين النوع الميثيلى والنوع البري. واليوم لدي عينات RNA من النوع البري والنوع الميثيلى، وسنقوم جميعاً بإجراء C أولاً.

نستخدم طرق الوسم غير المباشر، وتكمن ميزة هذه التقنية في منع انحياز العين الذي قد يحدث في الوسم المباشر. ولتحقيق ذلك، لدينا عينات من RNA، ونحرص على الحصول على 3 µg من RNA في حجم إجمالي قدره 13 µL. ثم نضيف 2.5 µg من random hexamers إلى العينات.

وسنقوم بحضن العينة عند 75 °C لإزالة الطبيعة من RNA لمدة ثماني دقائق. والآن سنضيف خليط النسخ العكسي الذي يحتوي على AM L-D-L-D-U-T-P continu mix، ومحاليل reverse transcriptase buffer، وكذلك ET TT، ثم نقوم برج العينة جيداً وحضنها عند 42 °C لمدة أربع ساعات. وبعد مرور أربع ساعات، نقوم بإخراج العينات.

والآن لدينا في الأنبوب خليط من cDNA و RNA. وما نريد فعله هو إجراء عملية تحلل RNA مائيًا عن طريق إضافة هيدروكسيد الصوديوم و EDTA، بحيث يكون التركيز النهائي لهيدروكسيد الصوديوم 100 mM، والتركيز النهائي لـ EDTA هو 5 mM.

والآن سنقوم بحضن العينات في حمام مائي عند 65 °C لمدة 10 دقائق. لقد انتهت عملية الحضن، وسنبدأ بمعالجة العينات عن طريق إضافة HEPES بتركيز pH 7 وصولاً إلى التركيز النهائي 500 molar. في هذه المرحلة، يمكنك تخزين العينات عند -20 °C أو المتابعة في إجراءات التنقية.

لتنقية الـ CDNA، نستخدم طقم تنقية PCR من KaiGen. ومع ذلك، وبما أن محلول Buffer Bush ومحلول Ion buffer يحتويان على المواد الحرة، فإننا نقوم بتحضير محلول Phosphate Bush buffer ومحلول Phosphate Ion buffer الخاصين بنا؛ حيث يتم إضافة 300 µL من PPI، ثم يتم سحب المزيج ببطء باستخدام الماصة، وبعد ذلك يتم نقل المزيج إلى الأعمدة، ثم يتم تدويره لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. بعد ذلك، يتم استخدام محلول الغسيل الذي قمنا بتحضيره، وهو Phosphate wash buffer، حيث يتم إضافة 750 µL منه، ثم يتم إضافة كمية أخرى وتدويرها مرة أخرى.

لذلك سنقوم بالطرد المركزي مرة أخرى للتأكد من ترسب كافة الكريات. ومن ثم سننقل هذه الأنابيب إلى أنابيب "إيفندور" فارغة، وسأضيف 30 µL من منظم الفوسفات E، وهو عبارة عن فوسفات البوتاسيوم بتركيز 4 mM وعند pH 8.5.

وهنا، عليك فقط التأكد من إضافة كل شيء إلى مركز العمود، ثم ستقوم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. لذا، سيعمل الجهاز على الدوران لمدة دقيقة واحدة مرة أخرى، وسأضيف 30 µL أخرى من منظم CDA، ثم أحضنها في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أقوم بإزالة العمود، وبذلك يكون لدينا حجم إجمالي قدره 60 µL من CDA.

بمجرد تنقية cDNA، يمكنك تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية، كما يمكننا تجفيفه ثم تخزينه، لذا يمكننا تجفيف cDNA في Vacufoil. والآن لدينا في الأنبوب cDNA جاف، وهو مُعدل. وما سأقوم به هو إعادة تعليق العينة الجافة في.

سأقوم بتعليق العينة في 10 µL من بيكربونات LAR بتركيز 15 عند pH 9. وسأفعل ذلك ببساطة عن طريق الماصة صعوداً وهبوطاً؛ ففي هذه الخطوة، من المهم جداً إعادة تعليق cDNA جيداً. لكي ينجح تفاعل الدمج، يجب أن يتم هذا التفاعل في غرفة مظلمة لأن العلامات الفلورية حساسة للضوء.

ومع ذلك، عند اختيار هذه المواد من علوم الحياة، فإنها تأتي في عبوات فردية. حيث يحتوي S5 على غطاء أرجواني، بينما يحتوي S3 على غطاء برتقالي؛ كما يظهر S5 باللون السماوي عند تعليقه، بينما يظهر Cary باللون الأرجواني. لذا، سأقوم في الغرفة المظلمة بنقل هذه العينات إلى أنابيب الصبغة، ثم سأعيد تعليق الصبغة وأنقلها مرة أخرى إلى الأنبوب الذي لدي.

بعد ذلك، سأقوم بالتحضين في الظلام لمدة ساعتين، وبعد انقضاء ساعتي التحضين، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 35 µL من خلات الصوديوم بتركيز 100 millimolar وعند pH 5.2. وبعد ذلك، قمنا بالتنقية باستخدام إجراء تنقية مماثل، ولكننا استخدمنا هذه المرة محلول الغسيل ومحلول الاستخلاص الموفرين من قبل شركة Qiagen.

يمكنك وصف المواضع التي وضعت فيها العينة، ومن ثم يجب تنظيف الجهاز. لذا يمكنك وضع عينتك أو مزيجك الآن، وهذه عينتي الموسومة بـ scifi، وما نراه هنا هو OD 260، والذي يوضح محتوى DNA، وOD 650، الذي يوضح دمج D لـ scifi. وهنا عينتي الموسومة بـ side three.

مرة أخرى، قم بتدوير ستة تركيزات وخمسة مقاييس 50 في الموقع ثلاثة للدمج. وبما أن عمل شركة D يسير بكفاءة، سأقوم بدمج العينات الآن، ثم اخلطها لفترة وجيزة. والآن سنقوم بكتابة عينة مرة أخرى باستخدام التغذية الراجعة.

حسنًا، من أجل تهيئة الشريحة، سنقوم بإعادة الترطيب عن طريق وضع الشريحة عالميًا فوق الماء، وهذا سيؤدي إلى تكبير البقع. ومن ثم لحماية ذلك، سنقوم بالتجفيف السريع عند 100 °C، ثم سنقوم بالتهجين بالأشعة فوق البنفسجية أو ربط البقع تساهميًا بالشريحة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية، وبعد ذلك سنقوم بالتحضين في محلول التلقيح المسبق المتوفر لدينا. لذا سأضع الشريحة ووجهها للأسفل، ولكن دون أن تلامس الماء بعد.

وسننتظر هكذا لمدة خمس دقائق. لذا، سيبدو هذا الصندوق أكبر، ويجب أن تكون العينات أكثر لمعانًا مما كانت عليه قبل الإضافة، ثم ستقوم بالتجفيف السريع بوضع الشريحة عند درجة حرارة 100 °C وستلاحظ وجود تكثيف. وسنقوم بعملية الربط التشعبي باستخدام youi.

بالنسبة لعملية الترطيب، سأقوم ببساطة بغمس الشريحة في ماء مسبق التسخين. ويجب أن تتم هذه العملية بسرعة كبيرة لأن الهدف هنا هو التخلص من جميع البقع أو جميع الـ oligos الموجودة على البقعة والتي لم يتم ربطها. وإذا تمت هذه العملية ببطء، فستظهر ذيول مذنبة (com tails) على البقع.

لذا، تأكد من القيام بذلك بسرعة، واحرص على عدم إخراج الشريحة من الماء، وكرر هذه العملية لمدة 30 ثانية، ثم جففها فوراً في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وبسرعة 700 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، نضع هذه الشريحة في محلول منظم للتحضير المسبق الذي أعددناه، وندفع الشريحة ببطء داخل الوعاء، ثم نحضنها عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على الأقل. هنا لدينا عينتنا المجففة التي سيتم إجراء التهجين لها، لذا سنقوم أولاً بإعادة تعليقها في الماء.

في هذه الخطوة، نقوم فقط بإعادة التعليق عن طريق تحريك الأنبوب للأعلى وللأسفل، مع الحرص على عدم تعريض العينة للضوء. ثم يتم إضافة 1.5 µL من DNA النطفي بتركيز 10 mg/mL، وإضافة 1.2 µL من tRNA.

التركيز هو 12.5 mg/mL، ونضيف tRNA وبعض الحمض النووي للنطاف (sperm DNA) لمنع الارتباط غير النوعي. ثم نضيف 5.35 µL من 0.3 XSSC، مما يعطي تركيزاً نهائياً قدره 3x. وأخيراً، نضيف 3.5 µL من SDS بتركيز 1%.

سنقوم الآن بغلي الخليط لمدة خمس دقائق، ثم سنقوم بالطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق، وسيكون جاهزاً بعد ذلك. لقد مرّت ساعة منذما قمنا بتحضين الشريحة، ولدي الآن الماء والإيزوبروبانول. لذا سأقوم برج الشريحة في الماء أولاً للتخلص من SDS، ثم أغسلها بالإيزوبروبانول وأضعها مباشرة في المقياس القياسي.

وهنا، يجب توخي الحذر لعدم تعريض الشريحة للهواء لفترة طويلة لمنع الجفاف. لذا، أنتقل مباشرة من محلول منظمة Harm Station إلى الماء لغسل الشريحة. استمر في ذلك لبضع دقائق، مع التأكد من أن الحركة تكون رأسية فقط (للأعلى وللأسفل) وليست جانبية.

وتأكد أيضاً من عدم بقاء الشريحة مغمورة في الماء، وسنقوم بنقلها إلى الإيزوبروبانول فوراً. وستبقى هنا لبضع دقائق أخرى. ومن فضلك، اترك الصفحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

700 R.Cool. وهكذا تصبح الشريحة جاهزة أيضاً للتهجين، ومن الأفضل الاحتفاظ بها في صندوق شرائح لحمايتها من الغبار. وبالنسبة لمحطة الحصاد، فسنستخدم الرفع أو الانزلاق.

توجد شرائح بيضاء على غطاء الشريحة، وهي التي ستعمل على رفع الغطاء وتوفير مساحة كافية لدخول العينة بين غطاء الشريحة والشريحة نفسها. وأقوم بتنظيفها باستخدام الإيثانول، ثم أضعها وأتأكد من عدم وجود أي جسيمات غبار. أولاً، سنأخذ شريحة القالب التي تحتوي على منطقة مطبوعة ومحددة، ونضع فوقها الشريحة التي جهزناها مع التأكد من محاذاتهما بدقة تامة.

تأكد من محاذاتها بشكل مثالي. وعليك التأكد من أن الأشرطة موجودة على الجانب الذي سنوجهه لأسفل. قد يكون من الصعب رؤيتها حقاً، ولكن تأكد من قدرتك على رؤيتها.

ويجب أن تكون الخطوط على جوانب الشرائح. وسنقوم بتحميل العينة من الجوانب. آخذ كميات صغيرة من العينة، لذا سآخذ 15 µL أولاً وأبدأ بالتحميل من الزاوية البعيدة عن غطاء الشريحة.

وببطء، أقوم بسحبه والتحرك على طول الحافة لتغطية المنطقة بالكامل. في هذه المرحلة، من المهم جداً عدم إدخال أي فقاعات، وأقوم بأخذ 15 µL أخرى من المادة المهاجرة ووضعها على جوانب الشرائح لمنع أي جفاف. وهكذا تصبح عينتنا جاهزة، ومن ثم يتم تحضين الشرائح في غرف التحضين التي تحتوي على قنوات دقيقة لترطيب الشريحة أثناء عملية التهجين.

وسنضيف 10 ميكرولتر من 3X SSC في الزوايا الست للشريحة. هناك ستة مواضع في الحجرة، عذراً، في كل زاوية وفي كل جانب. تأكد من نقل الشريحة برفق شديد حتى لا ينزلق غطاء الشريحة. وعندما تضع الشريحة في وضعها الصحيح، ستلاحظ أنها ستلتصق بالماء الذي وضعته تحت الغطاء. وتأكد من إحكام ربط البراغي.

سنقوم بحضن غرفة التحويل في حمام مائي عند درجة حرارة 65 °C، ولكننا لا نريد وضعها مباشرة في القاع. لذا، سنضع حاجزاً بلاستيكياً لمنع الانتقال المفرط للحرارة. ثم نضع غرفة التحويل برفق، ولتجنب حدوث أي إزاحة، يمكنك أيضاً وضع ثقل ما.

وستستمر هذه الحضانة طوال الليل، عادةً ما بين 10 إلى 12 ساعة. أما بالنسبة لغسل الشريحة، فنستخدم محلول 1X SSC مع 0.05% SDS، وذلك لإزالة غطاء الشريحة.

وسيكون هذا لغسل الخطوة الأولى. وسنقوم بخطوتين إضافيتين باستخدام 0.06% six XSC فقط لإزالة كل الـ SDS الموجود. لذا سنقوم بتجهيز المحلول ونأخذ الشرائح ونضعها ووجهها للأسفل في الحاوية.

سنقوم بهزّها من جانب إلى آخر، وسنلاحظ أن غطاء الشريحة سيسقط بلطف. حسناً، ومن ثم سننقلها إلى محلول غسيل آخر يحتوي على XES. انتظر لمدة دقيقة واحدة.

انتقل إلى الخطوة 06 XSSC. وللتأكد من التخلص من جميع الـ FDS، سنكرر العملية مرة أخرى. يتم استخدام جهاز الطرد المركزي للتجفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بسرعة 700 RP. احتفظ بهذه الشريحة في صندوق الشرائح لأنها حساسة للضوء.

هذا هو ماسح الشرائح، وستضع الشريحة هنا، في هذه المساحة الصغيرة، بحيث يكون الوجه لأسفل والعلامة موجهة نحو الداخل، وفي الشريحة الثانية ستقوم فقط بتحديد المنطقة التي ترغب في مسحها. وسنأخذ هذه المنطقة في شرائحنا؛ حيث استخدمنا 16 دبوساً لطباعة شرائحنا.

وبذلك، تتوافق كل كتلة مع دبوس واحد، وتحتوي الشرائح لدينا على أكثر من 8,000 نقطة. ونحن نمثل جينوم vi color مرتين لأن عدد جيناته يبلغ حوالي 4,000 جين؛ لذا يتوفر لدينا نقطتان لكل أوليغو نستخدمه.

وعند التكبير، ستلاحظون أنه في هذه التجربة المحددة، قمنا بمقارنة طفرات منظم النسخ بالنوع البري؛ حيث تم وسم الطفرة بـ scifi، والذي يعطي لوناً أحمر، بينما كان النوع البري site three، والذي يعطي لوناً أخضر. لذا، فإن أي جزء يظهر باللون الأحمر، مثل هذه البقع، يشير إلى أن وفرة النسخ في الطفرة كانت أعلى منها في النوع البري.

لذا تظهر باللون الأحمر أو درجات اللون الأحمر، وأي شيء يظهر باللون الأخضر يشير إلى أن وفرة النسخة كانت أعلى في النوع البري مقارنة بالطفرة. وأي بقعة تظهر باللون الأصفر تشير إلى أن تلك النسخة كانت موجودة بالتساوي في كل من الطفرة والنوع البري. لذا، عندما يتداخل اللونان، يظهران باللون الأصفر مثل هذه البقع.