الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

لإنتاج تسجيلات كهروفيزيولوجية مستقرة من الوصلات العصبية العضلية في يرقات Joof. أولاً، يتم تشريح اليرقة لفتحها وكشف جدار الجسم والعضلات والجهاز العصبي قبل البدء بالتسجيل. وتُقطع المحاور العصبية عند قاعدة الجهاز العصبي المركزي خلف العقدة البطنية.

بعد ذلك، يتم وضع قطب تسجيل على العضلة المستهدفة وقطب تحفيز بالقرب من العصبونات الحركية الموصلة لها. ثم تُسحب المحاور المقطوعة للعصبونات الحركية إلى داخل ماصة التحفيز. وعندئذٍ، يمكن تسجيل جهود الوصل الاستثارية.

مرحباً، أنا ويندي إم إل إيه من مختبر مكيب في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية الخلوية بجامعة كولومبيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس النقل التشابكي في الوصلة العصبية العضلية ليرقات GE. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الفسيولوجيا التشابكية والنقل العصبي.

لنبدأ الآن. لبدء التجربة، قم بتشريح اليرقات في مرحلتي التجول الثالثة والنجمية لكشف جدار الجسم. تم تعديل هذا البروتوكول للتجارب الفيزيولوجية الكهربائية عن طريق استخدام دبابيس تشريح قصيرة.

يتراوح طول هذه الأجزاء بين اثنين إلى أربعة مليمترات، وهي أقل عرضة لملامسة عدسة المجهس أو الأقطاب الكهربائية أثناء التجربة. بعد كشف جدار الجسم، استخدم الملقط للإمساك بالجهاز العصبي المركزي (CNS) ورفعه قليلاً، ثم اقطع المحاور العصبية الحركية للأعصاب الطرفية وأزل الدماغ.

بعد إزالة الدماغ، اغسل العينة التي تم تشريحها مرتين باستخدام محلول HL 3.1 المنظم مع 1 mM من الكالسيوم. الآن وبعد اكتمال عملية التشريح، يمكن إجراء التسجيلات داخل الخلوية من الخلايا العضلية لليرقة. ضع طبق التشريح على مجهر الفيزيولوجيا الكهربائية واغمر العينة بمحلول HL 3.1 المنظم مضافاً إليه الكالسيوم.

ثم قم بتثبيت قطب الحمام بحيث يكون ملامساً للمحلول. يُستخدم قطب الشفط لتحفيز الأعصاب الطرفية التي تغذي العضلة. ضع قطب الشفط في الطبق أولاً لتجنب الاهتزازات عند وضع القطب داخل الخلوي على العضلة.

بمجرد وضع القطب الكهربائي في الطبق، قم بتحديد موضعه بالقرب من العصبون الحركي الذي يغذي العضلة السادسة. في القطعة البطنية الثالثة، قم بتطبيق شفط خفيف حتى يصبح العصب المقطوع داخل الماصة الزجاجية. احذر من شد الأعصاب عند تطبيق الشفط.

ارفع الماصة قليلاً بحيث لا تلامس العضلة، ثم ضعها في موضع يضمن عدم سحب ألياف الأعصاب المقطوعة. وبمجرد استقرار قطب الشفط في مكانه، قم بوضع قطب التسجيل لإجراء التسجيلات داخل الخلوية.

استخدم قطبًا كهربائيًا دقيقًا حادًا مملوءًا بـ three molar potassium chloride. ثبّت قطب التسجيل فوق مركز العضلة السادسة. اضبط إزاحة الدخل بحيث تقرأ صفرًا بالنسبة لمحلول الحمام.

اخفض القطب ببطء واقترب من العضلة تحت تكبير بصري عالٍ حتى يلامس سطح العضلة. وللتأكد من اختراق العضلة، راقب راسم الإشارة (oscilloscope). يجب أن يكون جهد الغشاء وقت الراحة 60- millivolts على الأقل.

يجب أن يكون جهد الصفيحة المصغرة المتناثر مرئياً الآن. وبمجرد وضع قطب التسجيل في مكانه، اترك الخلايا تستقر لمدة دقيقة واحدة. وقبل البدء في التسجيلات، استخدم axon HS two، وهو رأس مرحلي في مضخم axle clamp two B للكشف عن التغيرات في جهد الغشاء.

يتم ربط جهاز تثبيت المحور (axle clamp two B) بجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج P clamp عبر محول البيانات (digit data. 1322 A)، الذي يعمل على تحويل الإشارة إلى صيغة رقمية. يتم تسجيل جهد الغشاء على جهاز الكمبيوتر. وباستخدام برنامج clamp X، يتم تطبيق المحفزات على المحور الحركي لتوليد جهود غشائية استثارية أو ejs.

بمجرد توليد الجهود الكهربائية الموصلة (ejs)، قم بتسجيل الجهود الكهربائية الموصلة المصغرة على مدار فترة زمنية مدتها ثلاث دقائق دون تشابك للمحفزات. يمكن استخدام برنامج تحليل "soft mini" لتحليل المخططات وتحديد سعة وتردد جهود ما بعد التشابك الكهربائية المصغرة (mini EJP). لتوليد الجهود الكهربائية الموصلة (ejs).

استخدم مولد نبضات رئيسي لتحفيز الطرف المقطوع من العصبون الحركي. يجب أن يقوم المولد بتسليم نبضات جهد مربعة بمدة 0.3 millisecond. اترك فاصلًا زمنيًا مدته خمس ثوانٍ بين المحفزات للسماح بالتعافي التشابكي.

عند الوصلة العصبية العضلية (NMJ)، قم بتسجيل 10 جهود مستثارة على الأقل من كل عضلة واحسب متوسط السعات. يوضح هذا الشكل أثراً نموذجياً تم تسجيله من العضلة السادسة ليرقة ذبابة فاكهة من النوع البري، مع استجابات جهود لوحية خارجية (EJP) مستثارة وجهود لوحية مصغرة (mini EJPs) تلقائية. لقد شرحنا للتو كيفية تسجيل الجهود من الوصلة العصبية العضلية ليرقات الدروسوفيلا. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إتمام عملية التشريح في غضون 3 إلى 10 دقائق والبدء في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية فوراً بينما لا تزال الخلايا سليمة ومستجيبة.

إذا استغرق التشريح وقتًا طويلاً، فإن جهد الغشاء الراحة للخلايا العضلية سيكون أقل من 60- millivolts، وهو مستوى منخفض للغاية بحيث لا يمكن تسجيله. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.